分子生物學第五章分子生物學研究法-資料下載頁
2025-01-13 08:02本頁面
【正文】 度下進行 ， 結合的特異性大大增加 ， 被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度 。 再通過選擇特異性和保守性高 的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 靈敏度高： PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 (pg=1012)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=6)水平。能從 100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中， PCR的靈敏度可達 3個 RFU(空斑形成單位 )；在細菌學中最小檢出率為 3個細菌。 簡便、快速： PCR反應用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在 DNA擴增液和水浴鍋上進行變性 退火 延伸反應，一般在 2～ 4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 對標本的純度要求低： 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞， DNA 粗制品及總 RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的 DNA擴增檢測。 （ 5） PCR的應用 ? 在分子生物學基礎研究上，ＰＣＲ被廣泛地用于基因克隆和制造突變。 ? 研究 ? 基因克隆， DNA測序，分析突變 ? 診斷 ? 細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ? 人類基因組工程 ? 遺傳圖譜的構建， DNA測序，表達圖譜 ? 法醫(yī) ? 犯罪現(xiàn)場標本分析 ? 腫瘤 ? 各種腫瘤檢測 ? 其他 …… ? 在臨床醫(yī)學上， PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。用傳統(tǒng)的方法，要檢測病毒、病菌的感染需要把病原體培養(yǎng)數(shù)周才能鑒定，而現(xiàn)在用 PCR，即可以迅速判斷人體細胞（比如血液細胞）中是否存在病毒、病菌的 DNA（比如 HIV的 DNA）而確診。 在法醫(yī)上， PCR目前已成為發(fā)現(xiàn)罪證的重要方法。比如， 含的 DNA就可以通過 PCR擴增而獲得足夠量的 DNA進行測序鑒定罪犯。毛發(fā)、血跡、唾沫、精液因此都可以成為重要的罪證。 利用 PCR技術，科學家們已從林肯的頭發(fā)和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千萬年前的昆蟲、恐龍的骨頭等不尋常的樣品中提取了足夠的 DNA進行研究。博物館中的化石標本都有可能成為遺傳學的研究對象，一門分子古生物學因此誕生。 PCR技術在法醫(yī)學中應用 實時定量 PCR 1. SYBR Green I探針 (1種熒光） 2. Taq Man探針 (2種熒光，短波長和長波長） 實時定量 PCR 1. 隨著新合成目的 DNA片段的增加，結合到 DNA上的熒光探針被激發(fā)的熒光相應增加。 2. Taq Man探針三要素： 短波長熒光基團 目的 DNA特異的堿基序列 長波長熒光基團 RNA基本操作技術 （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 應用 Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離 Poly(A)RNA。將(dT)引物與細胞總 RNA共溫育，加入與微磁球相連的吸附物，用磁場吸附與PMP相連的 Oligo(dT)mRNA。 RNA基本操作技術 （ 2）反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ? 可同時在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入 Oligo（ dT）1218mer及隨機引物 R6，以保證得到全長 cDNA；應選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶。 ? 應選用甲基化 dCTP；應保證所獲得雙鏈 cDNA的方向性。 54 核苷酸序列分析 ? 儀器分析發(fā)展很快。 ? 如果將來做測序工作，有了分子生物學基礎，就可以做。 ? 如果將來工作中需要測序，一般送到公司去測。 ? 下面介紹測序的基本原理。 54 核苷酸序列分析 ? Sanger雙脫氧鏈終止法 利用ＤＮＡ聚合酶能夠利用雙脫氧核苷三磷酸作底物摻入到核苷酸鏈中而終止ＤＮＡ鏈的生長（雙脫氧核苷三磷酸沒有 ３ ˊ－ＯＨ 基團）。 54 核苷酸序列分析 ? MaxamGilbert化學修飾法 硫酸二甲酯、肼、六氫吡啶 → 放射標記ＤＮＡ片段 → 堿基特異性切割→ 不同長度ＤＮＡ片段 → 凝膠電泳和放射自顯影 → 讀出ＤＮＡ序列。 54 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ序列分析自動化 四甲基若丹明作熒光劑。 激光 計算機自動分析 54 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ雜交測序法（ＳＢＨ） 寡 核苷酸探針 ＋靶ＤＮＡ → 完全雙鏈雜交分子 → 比較分析 → 推斷靶ＤＮＡ序列 54 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ雜交測序法（ＳＢＨ） ３ －Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ － ５ Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ －Ａ Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ －Ａ－Ｃ Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ －Ａ－Ｃ－Ｔ Ｔ－Ｃ－Ｇ －Ａ－Ｃ－Ｔ－Ｔ －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ ５ －Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｃ－Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｃ－Ｔ－Ｇ－Ａ－Ａ－ ３
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