分子生物學第五章分子生物學研究法(存儲版)
【正文】 RNA基本操作技術(shù) （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 應用 Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離 Poly(A)RNA。 ? 研究 ? 基因克隆， DNA測序，分析突變 ? 診斷 ? 細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ? 人類基因組工程 ? 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測序，表達圖譜 ? 法醫(yī) ? 犯罪現(xiàn)場標本分析 ? 腫瘤 ? 各種腫瘤檢測 ? 其他 …… ? 在臨床醫(yī)學上， PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。 再通過選擇特異性和保守性高 的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 SDS主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K能水解蛋白質(zhì)，特別是組蛋白，再用有機酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 ? 酶及其濃度 目前有２種 Taq DNA聚合酶， 催化一典型的 PCR反應約需酶量 (指總反應體積為 100uＬ時 )，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 設計引物應遵循以下原則： ①引物長度 : 1530bp，常用為 20bp左右。 （ 2） PCR技術(shù)的基本原理 ? 假定我們要研究的 DNA雙鏈兩端的序列是 ： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ? PCR前先人工合成兩段有 2030堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，把這兩段引物和 DNA模板、 DNA聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合在一起，我們就可以開始做 PCR了。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。在短短的幾年內(nèi)， PCR迅速成為分子生物學的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛的實際應用，被許多科學家視為近十年分子生物學領(lǐng)域最重要的一項技術(shù)突破。反應物加完后，溫度由 PCR儀調(diào)整，程序完成后可以拿到產(chǎn)物。3 基因擴增 ? 聚合酶鏈式反應 即 PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴增特定基因或 DNA序列的方法。 ? 再如 2%瓊脂糖凝膠可分離 300bp的雙鏈DNA分子，而分離 大片段 DNA就要用低濃度 (%%)的瓊脂糖凝膠。 ? 在一定的電場強度下， DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的 大小和構(gòu)型 。 5 1972， Boyer實驗室發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶 EcoR I能特異識別 GAAUC序列，將 DNA在這個位點切開產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。 5第五章 分子生物學研究方法 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 DNA操作技術(shù) RNA基本操作技術(shù) 核苷酸序列分析 ? 分子生物學 從 20世紀中葉開始高速發(fā)展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。1 重組 DNA技術(shù)史上的重大事件 ? 半個世紀以來，分子生物學研究主要取得了 3大成就 : 第一 解決了 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題 －－ 基因的分子載體是 DNA。 ? 限制性核酸內(nèi)切酶能從特定堿基序列位點切開 DNA。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。 ? DNA和 RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子 (磷酸基團 )，在電場中會向正電極的方向遷移。 ? 如 20%的 SDS凝膠可分離 16bp的 DNA小片段，而分離 1000bp的 DNA片段則用 3%的SDS凝膠。2 ? 以上循環(huán)在同一個 PCR管中進行。 Cetus給了 Mullis一萬美元 的獎金，隨后把這項技術(shù)的專利以 三億美元 的價格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。 PCR的改進與完善 ? 1988年初， Keohanog改用 T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的 DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種 DNA片段。 ? PCR即在體外模擬 DNA復制的過程，加熱變性使 DNA變成單鏈，人工合成 2個引物讓它們結(jié)合到 DNA模板的兩端， DNA聚合酶即可以大量復制該模板。 一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循 環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之 增多。 ⑦ 引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其 它序列無明顯同源性。 ? 模板 (靶基因 )核酸 模板核酸的量與純化程度，是 PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶 K來消化處理標本。 聚合酶合成反應的忠實性及 Taq DNA聚合酶耐高溫性 ， 使反應中模板與引物的結(jié)合 (復性 )可以在較高的溫度下進行 ， 結(jié)合的特異性大大增加 ， 被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度 。 （ 5） PCR的應用 ? 在分子生物學基礎(chǔ)研究上，ＰＣＲ被廣泛地用于基因克隆和制造突變。 PCR技術(shù)在法醫(yī)學中應用 實時定量 PCR
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