分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法(參考版)
2025-01-16 08:02本頁面
【正文】 4 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ雜交測序法（ＳＢＨ） 寡 核苷酸探針 ＋靶ＤＮＡ → 完全雙鏈雜交分子 → 比較分析 → 推斷靶ＤＮＡ序列 54 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ序列分析自動化 四甲基若丹明作熒光劑。4 核苷酸序列分析 ? MaxamGilbert化學(xué)修飾法 硫酸二甲酯、肼、六氫吡啶 → 放射標(biāo)記ＤＮＡ片段 → 堿基特異性切割→ 不同長度ＤＮＡ片段 → 凝膠電泳和放射自顯影 → 讀出ＤＮＡ序列。4 核苷酸序列分析 ? Sanger雙脫氧鏈終止法 利用ＤＮＡ聚合酶能夠利用雙脫氧核苷三磷酸作底物摻入到核苷酸鏈中而終止ＤＮＡ鏈的生長（雙脫氧核苷三磷酸沒有 ３ ˊ－ＯＨ 基團(tuán)）。 ? 下面介紹測序的基本原理。 ? 如果將來做測序工作，有了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，就可以做。 5 RNA基本操作技術(shù) （ 2）反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ? 可同時在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入 Oligo（ dT）1218mer及隨機(jī)引物 R6，以保證得到全長 cDNA；應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶。 2. Taq Man探針三要素： 短波長熒光基團(tuán) 目的 DNA特異的堿基序列 長波長熒光基團(tuán) RNA基本操作技術(shù) （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 應(yīng)用 Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離 Poly(A)RNA。博物館中的化石標(biāo)本都有可能成為遺傳學(xué)的研究對象，一門分子古生物學(xué)因此誕生。毛發(fā)、血跡、唾沫、精液因此都可以成為重要的罪證。 在法醫(yī)上， PCR目前已成為發(fā)現(xiàn)罪證的重要方法。 ? 研究 ? 基因克隆， DNA測序，分析突變 ? 診斷 ? 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 ? 人類基因組工程 ? 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測序，表達(dá)圖譜 ? 法醫(yī) ? 犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 ? 腫瘤 ? 各種腫瘤檢測 ? 其他 …… ? 在臨床醫(yī)學(xué)上， PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的 DNA擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。能從 100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中， PCR的靈敏度可達(dá) 3個 RFU(空斑形成單位 )；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為 3個細(xì)菌。 再通過選擇特異性和保守性高 的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的 。 PCR的基本原理 DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 95℃ 50℃引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 1輪結(jié)束 95℃第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 95℃ 50℃72℃Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 2輪結(jié)束 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 重復(fù) 30輪后 230=1,073,741,824 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 理想拷貝數(shù) =2n n 循環(huán)次數(shù) 實際拷貝數(shù) =(1+x)n X 平均效率 ,約為 n 循環(huán)次數(shù) 電泳分析 PCR設(shè)備 電泳分析 （ 4） PCR反應(yīng)特點
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