分子生物學(xué)技術(shù)(參考版)
2025-01-03 03:23本頁(yè)面
【正文】 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 PCR結(jié)合其它核酸分析技術(shù)，在精確區(qū)分病毒不同型、 不同株、不同分離物的相關(guān)性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可從分子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。② 在反應(yīng)液中加入標(biāo)記的 dNTP， 經(jīng) PCR將標(biāo)記物摻入到新合成的 DNA鏈中，從而制得放射性和非放射性標(biāo)記探針。 (3) 制備探針和標(biāo)記探針 PCR可為核酸雜交提供探針和標(biāo)記探針。 PCR技術(shù)適用于檢測(cè)慢性感染、隱性感染，對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒的檢測(cè)尤其適用。由于 PCR對(duì)檢測(cè)的核酸有擴(kuò)增作用，理論上既使僅有一個(gè)分子的模板，也可進(jìn)行特異性擴(kuò)增，故特異性和靈敏度都很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。 (2) 快速、準(zhǔn)確、安全檢測(cè)病原體 用 PCR技術(shù)不需經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和富集病原體，一個(gè) PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至 2小時(shí)就可 完成。 一般 PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對(duì)稱 PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為 50:1100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會(huì)被用完，大量生成一條單鏈的DNA， 分離單鏈即可直接進(jìn)行序列分析等研究。方法是使含已知序列和未知序列的 DNA片段環(huán)化，再用限制性內(nèi)切酶切開已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī) PCR操作就可大量擴(kuò)增未知序列。其基本方法是分離細(xì)胞總 RNA或 mRNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，通過(guò) DNA末端轉(zhuǎn)移酶在 cDNA 3’端加上同源多聚物 poly(dG)尾，通過(guò)與其互補(bǔ)的錨定引物 poly(dC)來(lái)保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。 (2) 錨定 PCR(Anchored PCR) 通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道欲擴(kuò)增 DNA或 RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。在 PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA， 再以 cDNA做為 PCR的模板，加入引物和 Taq DNA聚合酶按正常 PCR方式擴(kuò)增 cDNA。除反轉(zhuǎn)錄 PCR外，尚有不對(duì)稱 PCR、 反向 PCR、 錨定 PCR、 多重 PCR、 著色互補(bǔ) PCR、 免疫 PCR和套式PCR等。 PCR擴(kuò)增示意圖 PCR可擴(kuò)增雙鏈 DNA和單鏈 DNA， 并能以 RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 PCR以擴(kuò)增 cDNA。通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸 3個(gè)溫度的循環(huán)，模板上介于兩個(gè)引物之間的片段不斷得到擴(kuò)增。 這樣，目的的 DNA的數(shù)量將以 2n 2n的形式累積，在 2小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增30(n)個(gè)循環(huán)， DNA量達(dá)原來(lái)的上百萬(wàn)倍。模板 DNA變性、引物結(jié)合 (退火 )、引物延伸合成 DNA這三步構(gòu)成一個(gè) PCR循環(huán)。 1. PCR的基本原理和過(guò)程 PCR技術(shù)是在模板 DNA、 引物 和 4種脫氧單核苷酸存在的 條件下依賴于耐高溫的 DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。 三、 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction， PCR)由美國(guó)Centus公司的 Kary Mullis發(fā)明，于 1985年由Saiki等在 Science雜志上首次報(bào)道，是近年來(lái)開發(fā)的體外快速擴(kuò)增 DNA的技術(shù)。但該項(xiàng)技術(shù)的操作畢竟比常規(guī)方法復(fù)雜，費(fèi)用較高，在動(dòng)物檢疫中尚未推廣。核酸探針可用以檢測(cè)任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒 (菌 )株和寄生蟲。膜洗凈后 ,將繼續(xù)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測(cè)核酸單鏈在一定溫 度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過(guò)程。 的基本過(guò)程 雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操
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