分子生物學(xué)實驗-資料下載頁
2025-04-04 23:13本頁面
【正文】 滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇）。有些試劑 可直接加入DEPC，%～%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的 稀釋。此外，接觸標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。 注意：①DEPC是 潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。 %，室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后濕熱高壓滅菌徹底揮發(fā)去除DEPC后可以長期保存在室溫或4度冰箱，不宜反復(fù)使用。30.31. 非變性凝膠里面沒加變性劑，一般是SDS。非變性膠跑出來的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗，如EMSA。由于沒有變性劑的原因非變性膠電泳時除了與蛋白分子量有關(guān)也會受都電荷的影響，因此對蛋白等電點的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時需要倒轉(zhuǎn)電泳時的正負極。從跑的膠來看，變性膠會比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來則比較粗糙。32. [1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10MSE緩沖液， 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。 [2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1MSE緩沖液的電泳槽。 [3]使RNA變性（最多20μg），,10MSE緩沖液20ml，去離子甲酰胺10ml。 [4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。 [5]加2ml5載樣緩沖液。 [6]上樣、同時加RNA標(biāo)記物（同位素（32P）dCTP）。 [7]60伏電泳過夜。 [8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。 [9]室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉(zhuǎn)印。 [10]()中45min,使膠中和。 [11]20SSC洗膠1h。 [12]20SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 [13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。 3注意事項[1]嚴(yán)格遵守試驗規(guī)則，物必準(zhǔn)確。[2]由于好多藥品是有毒的，對人體有害，請注意自身安全，做好防護。33. 要進行北方雜合反應(yīng)前，必須先將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙（nitrocellulose membrane） 或尼龍膜 （nylon membrane） 上，這一個過程稱為轉(zhuǎn)印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛細管轉(zhuǎn)移法 （capillary transfer）、真空轉(zhuǎn)移法 （vacuum transfer） 與電轉(zhuǎn)印法 （electroblotting）。 毛細管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時所產(chǎn)生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費的時間比較長，以其不須要特別的儀器設(shè)備，毛細管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA時采用變性聚丙烯酰胺膠體電泳，則必須以電轉(zhuǎn)印法進行RNA轉(zhuǎn)印。至于膜的選擇，硝基纖維素膜的優(yōu)點是比較不會產(chǎn)生非專一性反應(yīng)；不過其一旦被潤濕再烘干的后，容易碎裂，不適用于進行多次雜合反應(yīng)。 尼龍膜的優(yōu)點是韌性好，與核酸結(jié)合的能力也相當(dāng)強，正可以彌補硝基纖維素膜的缺點，現(xiàn)已成為主流。 一旦將RNA轉(zhuǎn)移至膜上后，即可以利用紫外線照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加熱2 h） 將其固定于轉(zhuǎn)印膜上。34. 觀察結(jié)果 紫外燈下可見28S、18S和5S rRNA三條帶，觀察28S和18S二條帶是否清晰，若28S的熒光強度為18S的二倍以上，則說明RNA分子沒有降解。溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。28sRNA、18sRNA、5sRNA的確是rRNA，并且理論上講28S條帶的亮度應(yīng)該為18S條帶亮度的1～2倍，否則，當(dāng)18S條帶的亮度過高時說明28SrRNA可能降解為18SrRNA了，意味著RNA可能嚴(yán)重的講解了。 最后，這三條帶代表的是總RNA的提取程度，不能說明mRNA的提取量。28S比18S亮點比較好，5S亮的話就說明RNA降解了35. 通過電泳看5s 18s 28s的情況，分解后5s變亮，18和28連成一片，呈彌散狀。具體參考生物谷上面 這個RNA方面很多內(nèi)容的。使用普通的電泳也可以檢測，但是要用DEPC水來處理電泳槽和配緩沖液，電泳前最好在65攝氏度變溫一下。 裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解。 酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會造成損傷，因此應(yīng)注意防護。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時應(yīng)注意防護。 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。 取各上清時,不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾。 異丙醇,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。 提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進行無核酸酶化處理。 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。RNA酶是RNA降解的主要原因，RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶，除細胞內(nèi)RNA酶外，環(huán)境中的灰塵、各種實驗器皿和試劑、人類皮膚的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐熱、耐酸堿，煮沸也不能使之完全失活，蛋白變性劑可使之暫時失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。所以在RNA提取過程中必須避免外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶的活性。1 去除外源性的RNA酶污染實驗過程必須戴手套操作，%的DEPC（焦碳酸二乙酯，是RNA酶的強抑制劑）室溫攪拌過夜，然后高壓處理，玻璃器皿洗凈后在250攝氏度烘烤4小時。塑料器材最好使用滅菌的一次性用品等。2 抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性細胞破碎時，RNA酶釋放出來，所以力爭在RNA提取的初始階段，通過加入RNA酶抑制劑來抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性。11 /
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