分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-資料下載頁(yè)
2025-04-04 23:13本頁(yè)面
【正文】 滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇）。有些試劑 可直接加入DEPC，%～%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的 稀釋。此外，接觸標(biāo)本以及標(biāo)本有關(guān)的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。 注意：①DEPC是 潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。②含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。 %，室溫下持續(xù)攪拌過(guò)夜，分瓶包裝后濕熱高壓滅菌徹底揮發(fā)去除DEPC后可以長(zhǎng)期保存在室溫或4度冰箱，不宜反復(fù)使用。30.31. 非變性凝膠里面沒(méi)加變性劑，一般是SDS。非變性膠跑出來(lái)的蛋白能保持其活性一般用做功能試驗(yàn)，如EMSA。由于沒(méi)有變性劑的原因非變性膠電泳時(shí)除了與蛋白分子量有關(guān)也會(huì)受都電荷的影響，因此對(duì)蛋白等電點(diǎn)的確定和緩沖液的酸堿性有注意，有時(shí)需要倒轉(zhuǎn)電泳時(shí)的正負(fù)極。從跑的膠來(lái)看，變性膠會(huì)比較好看，帶比較窄，非變性膠跑出來(lái)則比較粗糙。32. [1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10MSE緩沖液， 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。 [2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1MSE緩沖液的電泳槽。 [3]使RNA變性（最多20μg），,10MSE緩沖液20ml，去離子甲酰胺10ml。 [4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。 [5]加2ml5載樣緩沖液。 [6]上樣、同時(shí)加RNA標(biāo)記物（同位素（32P）dCTP）。 [7]60伏電泳過(guò)夜。 [8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。 [9]室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。 [10]()中45min,使膠中和。 [11]20SSC洗膠1h。 [12]20SSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 [13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。 3注意事項(xiàng)[1]嚴(yán)格遵守試驗(yàn)規(guī)則，物必準(zhǔn)確。[2]由于好多藥品是有毒的，對(duì)人體有害，請(qǐng)注意自身安全，做好防護(hù)。33. 要進(jìn)行北方雜合反應(yīng)前，必須先將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至硝化纖維紙（nitrocellulose membrane） 或尼龍膜 （nylon membrane） 上，這一個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 （capillary transfer）、真空轉(zhuǎn)移法 （vacuum transfer） 與電轉(zhuǎn)印法 （electroblotting）。 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)所產(chǎn)生的牽引力量將RNA自洋菜膠體轉(zhuǎn)移至膜上；要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，以其不須要特別的儀器設(shè)備，毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA時(shí)采用變性聚丙烯酰胺膠體電泳，則必須以電轉(zhuǎn)印法進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)印。至于膜的選擇，硝基纖維素膜的優(yōu)點(diǎn)是比較不會(huì)產(chǎn)生非專一性反應(yīng)；不過(guò)其一旦被潤(rùn)濕再烘干的后，容易碎裂，不適用于進(jìn)行多次雜合反應(yīng)。 尼龍膜的優(yōu)點(diǎn)是韌性好，與核酸結(jié)合的能力也相當(dāng)強(qiáng)，正可以彌補(bǔ)硝基纖維素膜的缺點(diǎn)，現(xiàn)已成為主流。 一旦將RNA轉(zhuǎn)移至膜上后，即可以利用紫外線照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80℃加熱2 h） 將其固定于轉(zhuǎn)印膜上。34. 觀察結(jié)果 紫外燈下可見(jiàn)28S、18S和5S rRNA三條帶，觀察28S和18S二條帶是否清晰，若28S的熒光強(qiáng)度為18S的二倍以上，則說(shuō)明RNA分子沒(méi)有降解。溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。28sRNA、18sRNA、5sRNA的確是rRNA，并且理論上講28S條帶的亮度應(yīng)該為18S條帶亮度的1～2倍，否則，當(dāng)18S條帶的亮度過(guò)高時(shí)說(shuō)明28SrRNA可能降解為18SrRNA了，意味著RNA可能嚴(yán)重的講解了。 最后，這三條帶代表的是總RNA的提取程度，不能說(shuō)明mRNA的提取量。28S比18S亮點(diǎn)比較好，5S亮的話就說(shuō)明RNA降解了35. 通過(guò)電泳看5s 18s 28s的情況，分解后5s變亮，18和28連成一片，呈彌散狀。具體參考生物谷上面 這個(gè)RNA方面很多內(nèi)容的。使用普通的電泳也可以檢測(cè)，但是要用DEPC水來(lái)處理電泳槽和配緩沖液，電泳前最好在65攝氏度變溫一下。 裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解。 酚一定要堿平衡。苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會(huì)造成損傷，因此應(yīng)注意防護(hù)。氯仿易燃、易爆、易揮發(fā)，具有神經(jīng)毒作用，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。 取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾。 異丙醇,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。 提取DNA過(guò)程中所用到的試劑和器材要通過(guò)高壓烤干等辦法進(jìn)行無(wú)核酸酶化處理。 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。RNA酶是RNA降解的主要原因，RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶，除細(xì)胞內(nèi)RNA酶外，環(huán)境中的灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿和試劑、人類皮膚的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐熱、耐酸堿，煮沸也不能使之完全失活，蛋白變性劑可使之暫時(shí)失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。所以在RNA提取過(guò)程中必須避免外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶的活性。1 去除外源性的RNA酶污染實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須戴手套操作，%的DEPC（焦碳酸二乙酯，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑）室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后高壓處理，玻璃器皿洗凈后在250攝氏度烘烤4小時(shí)。塑料器材最好使用滅菌的一次性用品等。2 抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性細(xì)胞破碎時(shí)，RNA酶釋放出來(lái)，所以力爭(zhēng)在RNA提取的初始階段，通過(guò)加入RNA酶抑制劑來(lái)抑制內(nèi)源性的RNA酶的活性。11 /
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