分子生物學技術(shù)-資料下載頁
2025-01-01 03:23本頁面
【正文】 PCR等。 (1) 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription PCR，RT－ PCR) RT－ PCR用于擴增 RNA樣品。在 PCR體系中先引入反轉(zhuǎn)錄酶，將 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA， 再以 cDNA做為 PCR的模板，加入引物和 Taq DNA聚合酶按正常 PCR方式擴增 cDNA。 這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于 RNA和 RNA病毒的檢測。 (2) 錨定 PCR(Anchored PCR) 通常進行的PCR試驗必須知道欲擴增 DNA或 RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計引物進行PCR。 當欲擴增的片段序列未知時，可通過錨定 PCR進行擴增。其基本方法是分離細胞總 RNA或 mRNA并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，通過 DNA末端轉(zhuǎn)移酶在 cDNA 3’端加上同源多聚物 poly(dG)尾，通過與其互補的錨定引物 poly(dC)來保證擴增反應(yīng)的特異性。 (3) 反向 PCR(Inverse PCR) 常規(guī) PCR是擴增兩個已知序列之間的 DNA片段，反向PCR則用于擴增位于已知序列兩側(cè)的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的 DNA片段環(huán)化，再用限制性內(nèi)切酶切開已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī) PCR操作就可大量擴增未知序列。 (4) 不對稱 PCR(Asymmetric PCR) 不對稱PCR又稱單鏈擴增 PCR。 一般 PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對稱 PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為 50:1100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會被用完，大量生成一條單鏈的DNA， 分離單鏈即可直接進行序列分析等研究。 (1) 傳染病的早期診斷和不完整病原檢疫 在早期診斷和不完整病原檢疫方面，應(yīng)用常規(guī)技術(shù)難于得到確切結(jié)果，甚至漏檢，而用 PCR技術(shù)可使未形成病毒顆粒的 DNA或 RNA或樣品中病原體破壞后殘留核酸分子迅速擴增而測定，且只需提取微量 DNA分子就可以得出結(jié)果。 (2) 快速、準確、安全檢測病原體 用 PCR技術(shù)不需經(jīng)過分離培養(yǎng)和富集病原體，一個 PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至 2小時就可 完成。從樣品處理到產(chǎn)物檢測，一天之內(nèi)可得出結(jié)果。由于 PCR對檢測的核酸有擴增作用，理論上既使僅有一個分子的模板，也可進行特異性擴增，故特異性和靈敏度都很高，遠遠超過常規(guī)的檢測技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。 PCR可檢出 fg水平的 DNA，而雜交技術(shù)一般在 pg水平。 PCR技術(shù)適用于檢測慢性感染、隱性感染，對于難于培養(yǎng)的病毒的檢測尤其適用。由于 PCR操作的每一步都不需活的病原體，不會造成病原體逃逸，在傳染病防疫意義上是安全的。 (3) 制備探針和標記探針 PCR可為核酸雜交提供探針和標記探針。方法是：① 用PCR直接擴增某特異的核酸片段，經(jīng)分離提取后用同位素或非同位素標記制得探針。② 在反應(yīng)液中加入標記的 dNTP， 經(jīng) PCR將標記物摻入到新合成的 DNA鏈中，從而制得放射性和非放射性標記探針。 (4) 在病原體分類和鑒別中的應(yīng)用 用 PCR技術(shù)可準確鑒別某些比較近似的病原體，如藍舌病病毒與流行性出血熱病毒，牛巴貝斯蟲，二聯(lián)巴貝斯蟲等。 PCR結(jié)合其它核酸分析技術(shù)，在精確區(qū)分病毒不同型、 不同株、不同分離物的相關(guān)性方面具有獨特的優(yōu)勢，可從分子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。 此外， PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于分子克隆、基因突變、核酸序列分析、癌基因和抗癌基因以及抗病毒藥物等研究中。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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