【正文】 一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾 (甲基化 )作用且依賴于 ATP 的存在。 Ⅰ 類酶結(jié)合于識別位點并隨機(jī)的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA； III類酶在識別位點上切割 DNA 分子 ,然后從底物上解離。 Ⅱ 類由兩種酶組成 : 一種為限制性內(nèi)切核酸酶 (限制酶 ),它切割某一特異的核苷酸序列 。 另一種為獨立的甲基化酶 ,它修飾同一識別序列 。 實驗九 重組質(zhì)粒及表達(dá)載體 pET酶切分析 分子克隆中廣泛應(yīng)用的是： Ⅱ 類中的限制性內(nèi)切酶。 絕大多數(shù) Ⅱ 類限制酶識別長度為 4 至 6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列 (如 EcoRⅠ 識別六個核苷酸序列 :5‘ G↓AATTC3’),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。 Ⅱ 類酶切割位點在識別序列中 ,有的在對稱軸處切割 ,產(chǎn)生平末端的 DNA 片段 (如 SmaⅠ :5‘CCC↓GGG3’)。有的切割位點在對稱軸一側(cè) ,產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的 DNA 片段稱粘性未端 , 如EcoRⅠ 切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的粘性末端（ 5’G↓AATTC3’）。 BamH I pET32a多克隆位點上也有 BamHI位點 f i o r i g i nA p ro r it r x Al a c IT 7 p r o m o t e rM C SA v a IX h o IE a g IN o t IH in d I I IS a l IE c o R IS a c IB a m H IE c o R VN c o IB g l I IK p n IT 7 t e r m i n a t o rp E T 3 2 a ( + )5 9 0 0 b p克隆基因引物也加入了 BamHI位點 ? Primer5’:GGATCCATGGCGGAGAAAATCACG ? Primer3’:GGATCCCTATTCAGTGTCAGACGGCAAG 影響酶切反應(yīng)的因素 1. DNA 純度 2. 緩沖液 3. 溫度條件 4. 甘油含量 ? 溫度 ： 37OC（ BamH I 30OC） ? 甘油 ：控制在 10％以下 Takara公司提供的不同緩沖液 BamH I 二、實驗?zāi)康? 1 掌握限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)原理和方法； 2 將上一實驗獲得的重組質(zhì)粒及表達(dá)載體 pET進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化 （注：不需要酶切 pET質(zhì)粒，老師已經(jīng)為大家切好了） 三、實驗儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ：臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、 EP管、恒溫水浴鍋。 材 料 ： 重組質(zhì)粒和載體質(zhì)粒 試 劑： 內(nèi)切酶緩沖液（ 10*Buffer K， ddH?O）、內(nèi)切酶 BamH Ⅰ 。 內(nèi)切酶： BamH I 內(nèi)切酶緩沖液 : 10*Buffer K ddH2O 推薦一般反應(yīng)體系 四、實驗步驟 酶切反應(yīng)體系如下 (20μl )： 10*Buffer K 2μl 質(zhì)粒 DNA 3μl BamH I 1μl 補(bǔ)充 ddH2O到總體積 20μl 注：重組質(zhì)粒濃度為 12μ g/μ l ，短暫離心，于 37OC反應(yīng)23小時 一、實驗原理 實驗十 電泳分析酶切反應(yīng)及目的基因膠回收 pMDGene酶切分析 Marker pBluescriptCIPK酶切之前對照 pMD1433酶切之后產(chǎn)生較大的質(zhì)粒帶和較小的目的基因帶 pET32a酶切分析 pET 系統(tǒng)是有史以來在 中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。 pET 載體使目的蛋白的克隆、檢測以及純化更加容易。 載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。 ? 轉(zhuǎn)錄載體用以表達(dá)本身帶有原核核糖體結(jié)合位點和 AUG 起始密碼子的目的基因。只有 3 種轉(zhuǎn)錄載體： pET 21(+)、 pET 24(+)和 pET23(+)。 ? 翻譯載體包括來自 T7 噬菌體主要衣殼蛋白的高效核糖體結(jié)合位點，用于表達(dá)那些不帶有核糖體結(jié)合位點的目的基因。 ? 翻譯載體在命名上與轉(zhuǎn)錄載體不同，多一個字母后綴，例如 pET21a(+)，表示相對于 BamH I 克隆位點識別序列 GGATCC 的閱讀框。 ? 所有帶后綴 a 的載體從 GGA三聯(lián)密碼子開始表達(dá)，帶 b 的從 GAT 開始，帶 c 的從 BamH I 識別序列 ATC三聯(lián)密碼子開始。帶 d 后綴的載體閱讀框和帶 c 的一樣，不同的是它們有一個上游Nco I 克隆位點而非 Nde I 位點以便直接將目的基因克隆到 AUG起始密碼子。 f i o r i g i nA p ro r it r x Al a c IT 7 p r o m o t e rM C SA v a IX h o IE a g IN o t IH in d I I IS a l IE c o R IS a c IB a m H IE c o R VN c o IB g l I IK p n IT 7 t e r m i n a t o rp E T 3 2 a ( + )5 9 0 0 b p Marker 2. 表達(dá)載體 pET32a酶切之前對照 (可能是一條、兩條或是三條帶 ) pET32a酶切之后呈線性化，只有一條帶，而在瓊脂糖凝膠上，線性化的 DNA遷移率最慢。 二、實驗?zāi)康? 1 瓊脂糖凝膠電泳分析 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)； 2 將目的基因片段從凝膠上切下來，為目的基因片段凝膠回收作準(zhǔn)備。 三、實驗儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ：天平、電泳設(shè)備、臺式離心機(jī)、稱量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、 EP管、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。 材 料 ： pMDGene酶切產(chǎn)物 pET32a酶切 試 劑 ： 瓊脂糖， 1 TAE電泳緩沖液 、 溴化乙錠（ EB）、 6 Loading buffer、無菌去離子水、 DNA Marker； 四、實驗步驟 1. 1g 瓊脂糖加入 100ml TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。 2. 將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃ ）倒入，室溫冷卻凝固 3. 充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加 TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠 12mm。 4. 向 pSKCIPK酶切產(chǎn)物 EP管中分別加入 3μl 的6 loading buffer，混勻 ,全部上樣到凝膠點樣孔； ，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，調(diào)節(jié)電壓至 35V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約 30min60min。 ，再加入 5－ 10μl EB ，將凝膠放入盤中 2－ 3 分鐘 ，再紫外燈下檢測PCR產(chǎn)物的 DNA條帶 pSKCIPK酶切產(chǎn)生的目的基因帶從凝膠上切下來，切下的凝膠塊要盡量?。? 一、實驗原理 通過一定的方法將瓊脂糖凝膠上需要的目的 DNA帶回收下來，用于下游實驗。 實驗十一 DNA凝膠回收 瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法 是目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解 Buffer徹底溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過 10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實驗。這個方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目前最多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個方法不適合用于大片斷的回收。 傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在 TE溶液中 65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個方法現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了。 以前經(jīng)費(fèi)緊張，低熔點瓊脂糖貴，比較經(jīng)濟(jì)方法就是常規(guī)瓊脂糖電泳后，在目的條帶前方挖槽，灌入低熔點瓊脂糖，凝膠后再電泳一小會兒，等條帶進(jìn)入低熔點瓊脂糖區(qū)域再切出來，這樣就非常節(jié)約了。 二、實驗?zāi)康? 1. 從含有 目的基因片段凝膠塊上回收 DNA。 儀器及耗材 ：天平、臺式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、 EP管。 材 料 ： 含有目的基因酶切產(chǎn)物的凝膠塊 試 劑 ： AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒 ；無水乙醇； 三、實驗儀器、材料和試劑 四、實驗步驟 DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量（提前記錄 ml 離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如 100 mg=100 μl 體積）。 3個凝膠體積的 Buffer DEA，混合均勻后于 75oC加熱（低熔點瓊脂糖凝膠于 40176。 C加熱），間斷混合（每 23 min），直至凝膠塊完全熔化（約 68 min）。 Buffer DEA 體積的 Buffer DEB，混合均勻； 4. 吸取步驟 3中的混合液，轉(zhuǎn)移到 DNA制備管（置于 2 ml（試劑盒內(nèi)提供）離心管）中， 12,000 g 離心 1 min。棄濾液。 2 ml離心管，加 500 μl Buffer W1，12,000 g 離心 30 s，棄濾液。 2 ml離心管，加 700 μl Buffer W2，12,000 g離心 30 s，棄濾液。以同樣的方法再用 700 μl Buffer W2洗滌一次 12,000 g離心 1 min。 7．將制備管置回 2 ml離心管中， 12,000 g離心 1 min。 8．將制備管置于潔凈的 ml 離心管 (試劑盒內(nèi)提供 )中，在制備膜中央加 2530 μl Eluent 或去離子水，室溫靜置 1 min。 12,000 g離心 1 min 洗脫 DNA。