分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)操作-資料下載頁(yè)
2025-01-13 07:33本頁(yè)面
【正文】 新懸浮細(xì)菌，涂布于含有相應(yīng)抗性的 平板； （ 5）涂布好的板先于 37℃ 正置培養(yǎng)一段時(shí)間，至板上看不見(jiàn)明顯的菌液，然 后 37℃ 倒置過(guò)夜培養(yǎng)，形成單菌落； * 一般培養(yǎng)時(shí)間不能超過(guò) 16小時(shí)，否則會(huì)長(zhǎng)出小的衛(wèi)星菌落，不宜挑出單克 隆； 陽(yáng)性克隆的簽定 （ 1）于無(wú)菌操作臺(tái)中，將板上的單克隆接種到 3ml含相應(yīng)抗性的 LB培養(yǎng)集中， 37℃ ， 220rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜； （ 2）菌液 PCR驗(yàn)證初步驗(yàn)證， 20μl體系如下： 10 PCR buffer 2μl dNTP Mix(各 mM) 上游引物 P1（ 10 mM） 下游引物 P2（ 10 mM） 菌液 酶（ 5U/μl） 滅菌雙蒸水 μl 陽(yáng)性克隆的簽定 菌液 PCR應(yīng)注意： *上下游引物最好一條來(lái)自于載體，另一條為特異性引物； * PCR循環(huán)數(shù)不宜多，一般 25個(gè)循 化就行，多了易出現(xiàn)假陽(yáng)性； *菌落 PCR一定要建立陰性對(duì)照 陽(yáng)性克隆的簽定 （ 3）將初步確定為陽(yáng)性的克隆保菌（ 15%甘油），抽質(zhì)粒，送樣測(cè)序； （ 4）分析測(cè)序結(jié)果，將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的甘油菌編號(hào)，貼標(biāo)簽，質(zhì)粒若短期 內(nèi)需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，則可以暫存區(qū) 20℃ ，長(zhǎng)期保存則應(yīng)置于 80℃ 。將 克隆過(guò)程中未經(jīng)測(cè)序簽定及測(cè)序結(jié)果不對(duì)的質(zhì)粒及時(shí)丟棄，做好質(zhì)粒樣本貯 存登記、克隆的具體實(shí)驗(yàn)記錄、 DNA質(zhì)量鑒定記錄等，并由專(zhuān)人統(tǒng)一保管。 TA克隆的步驟 1 割膠回收 PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行； * 割膠回收前一定要注意， PCR采用的 DNA聚合酶是否有加 A功能，如果有，可直 接割膠回收，如果沒(méi)有， PCR結(jié)束后必須進(jìn)行加 A處理，一般 50微升的 PCR體系 中加入 2微升 dNTP，補(bǔ)加 Taq酶， 72℃ 延伸 10min即可； * 為防止污染，電泳緩沖液應(yīng)該是新鮮配制的；割膠時(shí)，應(yīng)擦凈臺(tái)面，最好用新的 刀片割膠； * 凝膠暴露在紫外下的時(shí)間盡可能短，避免造成核苷酸突變； TA克隆的步驟 2 連接 （ 1）無(wú)菌離心管中加入 pMD19T載體和適量的目的片段，通常載體和目標(biāo) 片段的摩爾比為 1： 210； * 一般情況下，割膠回收后的 DNA片段取 5μl電泳檢測(cè)，如果能看得見(jiàn)帶，加入 ， TA克隆一般都能獲得較高的陽(yáng)性率 （ 2） 加入與 (1)等體積 的 Solution I連接液 ，混勻， 16℃ 反應(yīng) 60分鐘，一般連接體系 為 10μl； * 連接時(shí)間根據(jù)所插入片段的大小情況而定，一般插入片段小于 1000bp，連接 13小時(shí)，較大片段連接過(guò)夜 TA克隆的步驟 3 轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆的篩選及保存 轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆的篩選及保存同前述酶切載體和目的片段連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn) 化及篩選，只是在涂板的時(shí)候要加入 40μl Xgal(20mg/ml) ， 7μl IPTG (200mg/ml) 進(jìn)行藍(lán)白篩選，驗(yàn)證的時(shí)候挑取白色菌落進(jìn)行 PCR驗(yàn)證 * TA克隆一般都能獲得較高的陽(yáng)性率，所以只要取少量菌液涂布，避免長(zhǎng)太多克 隆而無(wú)法挑菌驗(yàn)證； * 在挑取單克隆之前，可以將培養(yǎng)皿至 4℃ 放置 12h，充分顯色，讓藍(lán)斑更加明顯 4 實(shí)驗(yàn)中的一些好的習(xí)慣 （ 1）實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)時(shí)不亂想，不聊天，避免加錯(cuò)試劑； （ 2）槍頭頭吸完后馬上從移液器上取下，以免忙亂的時(shí)候又以同一槍頭吸取 另一種試劑；移液槍用完之后要調(diào)到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧 失去彈性而影響精確度； （ 3）所有的試劑都要即時(shí)標(biāo)注好配制日期、藥品名稱(chēng)、濃度等； （ 4） 加試劑之前，先混勻，以免放置時(shí)間長(zhǎng)了濃度不均； （ 5） 用完的玻璃器皿，及時(shí)清洗，并放入烘箱； 4 實(shí)驗(yàn)中的一些好的習(xí)慣 （ 6）做完實(shí)驗(yàn)擦干桌子，一切東西歸位，有些東西可以回收利用的就回收，同 時(shí)關(guān)閉相關(guān)儀器； （ 7）不管大小實(shí)驗(yàn)，做完后都要認(rèn)真做記錄，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果； （ 8）完成一個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)及時(shí)整理，如陽(yáng)性質(zhì)粒，甘油菌等，做好標(biāo)注及貯存記錄； （ 9） 做好實(shí)驗(yàn)室的交流工作； （ 10）離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前一定要注意水，電是否安全。
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