分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件-文庫吧資料
2025-08-11 03:22本頁面
【正文】 貝。③延伸：在DNA聚合酶和4 種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，539。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA 結(jié)合的特異性。PCR PCR即聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是近年發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異性DNA 的技術(shù)。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。二、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶酶切 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。 以5000rpm離心濃縮菌液，在超凈工作臺(tái)上分別取上述兩個(gè)離心管中的菌液100μl ，各自涂布于一個(gè)含Amp的篩選平板上，用標(biāo)記筆分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)化組、對(duì)照組，待菌液干后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1624小時(shí)（第二天下午3：00后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。將兩個(gè)離心管同時(shí)轉(zhuǎn)入42℃水浴中熱激90秒后，迅速置于冰上12分鐘。3．pUC19質(zhì)粒 配制成約50ng/μl。三、試劑與儀器設(shè)備：1．LB培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：蛋白胨(typtone) % （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction) % （）氯化鈉 % （1 g/100 ml）PH 固體培養(yǎng)基：100 含氨芐青霉素（Amp）50mg/l的固體LB培養(yǎng)基 %瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手時(shí)加入Amp鋪培養(yǎng)皿。本實(shí)驗(yàn)使用的pUC19質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp )，理論上只有轉(zhuǎn)入了pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。二、實(shí)驗(yàn)原理用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后，通過熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中。否則會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。步驟3和4中，對(duì)離心機(jī)應(yīng)當(dāng)做什么樣的預(yù)處理？答：由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在低溫下進(jìn)行，因此需要對(duì)離心機(jī)進(jìn)行4 ℃的預(yù)冷。注意：實(shí)驗(yàn)從第三步開始，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都必須無菌操作！五、思考題用試劑瓶盛裝的氯化鈣在滅菌時(shí)應(yīng)怎樣操作？答：可以高溫高壓滅菌，也可以過濾滅菌。，用5 ml的移液管（已滅菌）量取5 ml預(yù)冷的氯化鈣溶液加入離心管中，用手輕彈管壁將沉淀混勻,兩小組間用氯化鈣平衡，冰浴25 min（可延長(zhǎng)） ,待有8管后4000rpm，4 ℃,離心10 min。學(xué)生操作：（按實(shí)驗(yàn)一確定的4人組）領(lǐng)取一支離心管（已滅菌，不要隨便打開），貼上自己的標(biāo)簽（鉛筆寫學(xué)號(hào)），按老師安排兩個(gè)小組同步在超凈工作臺(tái)上工作，每個(gè)小組用10 ml的移液管（已滅菌）吸取10 ml菌液放入自己的離心管中，兩個(gè)小組將離心管與蓋子一起置天平上進(jìn)行平衡，平衡后蓋上蓋子置于盛有冰塊的盆中冰浴10分鐘（時(shí)間可超過十分鐘）。四、 實(shí)驗(yàn)步驟教師完成：、外觀呈圓形的單菌落，接種于實(shí)驗(yàn)一配好的LB液體培養(yǎng)基（試管裝）中，37 ℃ 200rpm振蕩培養(yǎng)14 h 。三、 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑實(shí)驗(yàn)材料 前次實(shí)驗(yàn)中所復(fù)壯的大腸桿菌單菌落液體培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器具 低速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、50 ml 離心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三種器具均已經(jīng)過滅菌處理）。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油或70℃保存（有效期6個(gè)月）。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。 在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。這說明產(chǎn)生只有超螺旋的正常質(zhì)粒閉合環(huán)雙鏈DNA。 此外，電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為12mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。 （3）指示劑監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。 （2）增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。電泳中用到兩種buffer，各自的作用。六、思考題電泳時(shí)所加電壓值如何確定?答：可根據(jù)DNA大小來確定，越大的電壓可低點(diǎn)，避免拖尾現(xiàn)象；越小的電壓可適當(dāng)大一點(diǎn)縮短電泳時(shí)間，避免時(shí)間過長(zhǎng)DNA擴(kuò)散導(dǎo)致條帶模糊。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析質(zhì)粒DNA電泳條帶的形態(tài)。[注意] EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。 染色：,室溫下染色2025分鐘。控制電壓保持在5V/cm。注意每加完一個(gè)樣品要更換tip槍頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 加樣：取1μl DNA溶液與適量載樣緩沖液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入1TAE緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封擋板內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。上樣6ul時(shí)750bp的帶約為100ng，其余帶約為50ng7．各種國(guó)產(chǎn)移液器(10，20，100μl)8．消毒的tips槍頭9．水平電泳槽和電泳儀四、實(shí)驗(yàn)步驟膠液的制備：,置于錐形瓶中,加入50ml 1TAE稀釋緩沖液,放電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,％瓊脂糖凝膠液。5．溴化乙錠(EB)溶液 10mg/ml(避光保存)，每100ml瓊脂糖凝膠加5μl貯存液，此試劑為強(qiáng)致癌物，要戴手套操作，避免污染環(huán)境。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動(dòng)速度快，開環(huán)與線狀分子的泳動(dòng)亦有差異，于是在電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生三個(gè)
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1