【正文】 文序列的特異核苷酸對。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA 線狀DNA ocDNA。6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。并在專門的實驗室內(nèi)使用。3．電泳時應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。四、常見問題及注意事項1．配瓊脂糖時應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。(5）電泳完畢后，取出凝膠， ug/ml的溴化乙錠1TAE用清水漂洗10 min。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。：取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)： g中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小燒杯。配制：10 ml溴酚藍mg二甲苯青FFmg甘油ml用6TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。室溫保存。溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。高溫高壓滅菌，室溫保存。凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris乙酸， mol/L EDTA（pH ）15 分子的大小來使其分離?！?0kb范圍內(nèi)的DNA片段。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對可DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在二、儀器及試劑：水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。由于架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。 ml離心 ：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。14 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒四、常見問題及可能原因：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。（堿裂解法）（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml TrisHCl（）平衡苯酚，加入 13500 ml。10TE緩沖液（pH ）：100 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml mol/LTrisHCl 緩沖液(pH )100ml500 mmol/L EDTA()ml加入約800 ml的去離子水，均勻混合。5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸鉀g冰醋酸 ml加入300 ml去離子水后攪拌溶解。注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS配制： 500 ml10% SDSml2N NaOHml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。二、儀器及試劑：37℃恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。實驗二質(zhì)粒DNA一、實驗原理細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。（2）滅菌液體時，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。設(shè)定當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達到設(shè)定溫度，～；此時，將100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。按增加鍵或減少鍵，時間采用倒計時，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行移位；進行時間設(shè)定確認。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數(shù)滅菌所需時間。（7）設(shè)定時間：按一次確認鍵，將溫度設(shè)定切換成時間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認鍵，定時器開始倒計時。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。先按控制面板上確認鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進入溫度設(shè)定狀態(tài)。（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。（2）通電：連接自動進水裝置。下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX40BI）的使用方法。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。對于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。器皿及實驗用具，應(yīng)嚴格滅菌，有的實驗～設(shè)備停運時間超過天開機沖洗一次。必須注意定期沖洗維護。當(dāng)高純水出口 115～3噸，約二至四個月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。天開機30分鐘沖洗一次，冬季每隔（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動數(shù)秒鐘又停機，此為管路漏水引起，需及時打開機箱加以解決。（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。只要管路閥門不漏，也可使機子保持自動待機狀態(tài)。一杯水后再取新鮮水。(2）開機：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機啟動產(chǎn)水，同時廢水排出，指示燈亮起，并處于自動運行狀態(tài)。(1)準(zhǔn)備：先檢測與純水機相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。ROMB反滲透高純水機（杭州永潔達）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：；可用自來水制成普通實驗用水和高純水，同時滿足不同水質(zhì)要求。如美國微孔濾膜公司的MilliQ超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應(yīng)、組織和細胞培養(yǎng)等實驗。許多實驗還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進行處理。Start”鍵，電機開始運行，時間開始計時。關(guān)機后，要等一段時間再開機。（2）運行過程可以打開箱蓋，這樣電機不運行，時間也停止，蓋上蓋接著運行。（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進行第2步參數(shù)設(shè)置?？稍谒俣龋瑴囟?，時間，運行等四部分之間切換。(2）工作程序設(shè)置。(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：000屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時間，不設(shè)定時可自動累計時間一直運行。SHK99Ⅱ型臺式空氣恒溫搖床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度177。（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。該軟件提供對電泳凝膠、“停止采集”、“采集圖像”等。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開始運行。按“Stop”可停止運行。還可進入“條帶分析”系統(tǒng)，對條帶 lid temp：℃”enter”鍵進入，用四個移位鍵移動設(shè)定位置。(3)對讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動電泳凝膠分析系統(tǒng)。（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰。此外，還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。在與確定量，是分子生物學(xué)及生化蛋白試驗的重要檢測工具。從第一步依次按“間，全部參數(shù)設(shè)置完后，按“(5）運行程序。性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設(shè)定為程序。在準(zhǔn)備狀態(tài)下按“C ”鍵(programs)進入編程狀態(tài)，選定一程序號，然后按“enter”鍵，進入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號（empty program）；再按“enter”鍵，進入下一程序；按“ABC”鍵，進入下一程序，用上下左右鍵號選擇一個字母（A、B、C、D、?），然后按“enter”鍵，進入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。若儀器正在運行時，須按“B ”鍵（start/stop），才能退出運行并返回準(zhǔn)備狀態(tài)。DNA片段，它的每一循環(huán)包括在DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個過程。當(dāng)處于關(guān)機 或在插入樣品溶液前，用待測pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進行自動溫度那么此時溫度探棒是不用連接，209?，F(xiàn)介紹PCR 擴增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項。溫度可通過“六、PCR儀PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，它是使一對寡核苷酸引物結(jié)合到正負上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列三種不同溫度進行DNA變性、引物復(fù)性、PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進化分析、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等等。（3）如儀器已測過幾種不同的樣品溶液，請用自來水清洗，樣品清洗電極。沒有校正或電極變干。（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。校準(zhǔn)完畢后，儀器自動進入溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。按“CFM”鍵確認校正值。當(dāng)讀數(shù)不穩(wěn)定時，屏幕會顯示“NOTREADY”；當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定時，屏幕會顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認校準(zhǔn)值?！妗辨I來調(diào)節(jié)。（3）pH校準(zhǔn)。（2）取出電極保護套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會消逝?？捎脺厮蛳←}酸，乙醇15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。l，容量大小根據(jù)需要。g/181。l或5。以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過五、數(shù)字式酸度計酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。(5）一個樣品測定完畢，按“(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。(4)按“set ref”鍵，進行空白測試。在顯示屏上：以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“新設(shè)定。(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。4分光光度計由光源、GeneQantTM Pro2h，以。l和5～7181。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分光光度計隨之應(yīng)用。on”，天平則自動進行靈敏度及零點調(diào)節(jié)。下面介紹紫外可見光分光光度計的使用方法。光密度（而測定某一溶液對該單色光的吸收值。而且精度低，已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。（4）電子分析天平若長時間不使用，則應(yīng)定時通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。（2）稱量時應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動引起天平擺動?！辨I自動校對零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。（3）稱量時將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點擊“174。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。目前實驗室常規(guī)備用的是自動化程度較高的電子分析天平。～ ； 法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。如果輸入錯誤，可之后逐漸將輸出電壓加 MO”號存儲單元。U：5 3注意安全。三、分析天平分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 T，按“選擇”鍵，先使 4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，“No Load！時，首先應(yīng)關(guān)機檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良T反顯，然后輸入數(shù)字Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風(fēng)通道。⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：(1)U、I、P三個