【正文】 二、儀器及試劑：恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)。 JM109菌株為受體細(xì)胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。若將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長增殖。C短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0176。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會易于吸收外源DNA。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進(jìn)行幾個酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。滅活的方法可分為三種：，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果。DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當(dāng)樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。DNA純度的另一個指標(biāo)是不可含有微量的DNA酶。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時也會影響酶切效果。常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進(jìn)行，但也可以根據(jù)切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。(3)反應(yīng)體積與時間酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul?，F(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供410種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激1h內(nèi)完全切TrisHCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護(hù)還原性基團(tuán)；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強(qiáng)度。保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。為了達(dá)到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時才能達(dá)到最佳酶切效果。限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。：1mmol/LDTT：200500ug/ml BSA：度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導(dǎo)致酶分子變性。常用的保存緩沖液各組分作用如下：TrisHCl（―）：維持穩(wěn)定的pH范圍。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產(chǎn)生所謂星號 206000 r/min，必須用 等情況下，都有可能出現(xiàn)星號活性。NACL和存在Mx ul（依質(zhì)粒濃度而定）加至10 ul 鑒定酶切反應(yīng)效果，DNA片段的大小。取5ul酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆?。，加入的酶量按?0%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng)活性的可能，即在識別序列以外的位點進(jìn)行切割。加酶時吸頭深入不可過深。，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。37℃水浴消化，分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時進(jìn)行電泳以確定應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。6上G……根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，～用量在～分子上有多個限制1． PCR薄壁離心管中進(jìn)行。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，CTT AAG?? 5′5′突出末端：AATTC……EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應(yīng)和體積為20 μ50～100 μl，DNA在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設(shè)備等。三、操作步驟3′??……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。大量的酶切反應(yīng)。5′??GAATTC??3′EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序，形成兩個 和……G這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點已被確定。限制性內(nèi)切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA 線狀DNA ocDNA。6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。并在專門的實驗室內(nèi)使用。3．電泳時應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。四、常見問題及注意事項1．配瓊脂糖時應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。(5）電泳完畢后，取出凝膠， ug/ml的溴化乙錠1TAE用清水漂洗10 min。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)： g中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小燒杯。配制：10 ml溴酚藍(lán)mg二甲苯青FFmg甘油ml用6TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。室溫保存。溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。高溫高壓滅菌，室溫保存。凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris乙酸， mol/L EDTA（pH ）15 分子的大小來使其分離?！?0kb范圍內(nèi)的DNA片段。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對可DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在二、儀器及試劑：水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。由于架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。 ml離心 ：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。14 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機(jī)在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒四、常見問題及可能原因：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。（堿裂解法）（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細(xì)菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml TrisHCl（）平衡苯酚，加入 13500 ml。10TE緩沖液（pH ）：100 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L EDTA配制：1000ml mol/LTrisHCl 緩沖液(pH )100ml500 mmol/L EDTA()ml加入約800 ml的去離子水，均勻混合。5 mol/L 冰醋酸配制：500 ml醋酸鉀g冰醋酸 ml加入300 ml去離子水后攪拌溶解。注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS配制： 500 ml10% SDSml2N NaOHml取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。二、儀器及試劑：37℃恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、微量移液器、50 ml離心管、 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。實驗二質(zhì)粒DNA一、實驗原理細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細(xì)胞質(zhì)中、獨立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。（2）滅菌液體時，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。設(shè)定當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度，～；此時，將100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。按增加鍵或減少鍵，時間采用倒計時，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位；進(jìn)行時間設(shè)定確認(rèn)。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數(shù)滅菌所需時間。（7）設(shè)定時間：按一次確認(rèn)鍵，將溫度設(shè)定切換成時間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認(rèn)鍵，定時器開始倒計時。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。先按控制面板上確認(rèn)鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。（2）通電：連接自動進(jìn)水裝置。下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX40BI）的使用方法。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。對于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。器皿及實驗用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌，有的實驗～設(shè)備停運時間超過天開機(jī)沖洗一次。必須注意定期沖洗維護(hù)。當(dāng)高純水出口 115～3噸，約二至四個月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。天開機(jī)30分鐘沖洗一次，冬季每隔（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動數(shù)秒鐘又停機(jī)，此為管路漏水引起，需及時打開機(jī)箱加以解決。（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。只要管路閥門不漏，也可使機(jī)子保持自動待機(jī)狀態(tài)。一杯水后再取新鮮水。(2）開機(jī)：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機(jī)啟動產(chǎn)水，同時廢水排出，指示燈亮起，并處于自動運行狀態(tài)。(1)準(zhǔn)備：先檢測與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。ROMB反滲透高純水機(jī)（杭州永潔達(dá)）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：；可用自來水制成普通實驗用水和高純水，同時滿足不同水質(zhì)要求。如美國微孔濾膜公司的MilliQ超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實驗。許多實驗還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進(jìn)行處理。Start”鍵，電機(jī)開始運行，時間開始計時。關(guān)機(jī)后，要等一段時間再開機(jī)。（2）運行過程可以打開箱蓋，這樣電機(jī)不運行，時間也停止，蓋上蓋接著運行。（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進(jìn)行第2步參數(shù)設(shè)置。可在速度，溫度，時間，運行等四部分之間切換。(2）工作程序設(shè)置。(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：000屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時間，不設(shè)定時可自動累計時間一直運行。SHK99Ⅱ型臺式空氣恒溫?fù)u床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度177。（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。該軟件提供對電泳凝膠、“停止采集”、“采集圖像”等。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開始運行。按“Stop”可停止運行。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng)，對條帶 lid temp：℃”enter”鍵進(jìn)入，用四個移位鍵移動設(shè)定位置。(3)對讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動電泳凝膠分析系統(tǒng)。（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光