【正文】 析，其余置4℃保存?zhèn)溆谩?0－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec離心四、注意事項： 體系所加成分的實際用量應根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。五、影響PCR的主要因素單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，PCR反應時模板變性要充分。PCR引物設計是否成功是能否獲得高質(zhì)量應用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：（1）PCR引物的長度約為以使它們在相近的溫度下與其互補序列結(jié)合。隨機的，應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物免選用T ,尤其應避免連續(xù)出現(xiàn)（2）一般來說，PCR引物長度選擇24bp左右為宜。（3）要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個互之間的3，末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。（4）引物的熔點溫度（引物的GC/AT應與要擴增的模板（5）引物的3，末端必須與模板嚴格互補，而（6）目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件，從基因序列，并對設計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進行分析評價。PCR18～30個核苷酸，并且成對引物間的2個以上T500bp時，引物長度選擇 Tm值）要適當。DNA相當或略高些。一般熔點溫度以大于DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋一般為100ul反應液有105106個目標分子。PCR產(chǎn)物最關鍵的因素之一。在設計和G＋C含量應相似。G+C含量應為45%～55%之間。堿基分布是尤其是不應在其3，端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避1618bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時，PCR引物相 Tm值與引物的堿基組成和長度有關；PCR55℃為宜。5，末端的要求可靈活些。EMBL或Genebank中查找有關均可作為的模板。產(chǎn)物≤（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴增產(chǎn)物，一般在酶切位點的5，端再加上幾個額外的堿基。（8）引物的濃度，～ umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同， umol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一乃不經(jīng)濟，二則會出現(xiàn)非特異擴增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。（如Taq DNA聚合酶） U/100uL 反應體積。酶量過多易導致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。PCR常用的dNTP濃度在50200umol/L。四種低則反應速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的因PCR反應中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應液中游離應按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的Mg2+。Mg2+離子濃度可顯著影響出現(xiàn)非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。應用無核酸酶的及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護作用。預變性：起始變性的時間應該長些，以使變性充分。一般為不完全時，DNA雙鏈會很快復性，影響PCR反應，但若變性溫度太高（不宜超過會影響Taq酶的活性。變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。引物退火：應根據(jù)具體反應中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為5072℃。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物酸的錯誤延伸。延伸：一般為72℃ 6090s。最后一個循環(huán)后應在物合成的完整性。7．平臺效應和PCR循環(huán)的次數(shù)dNTPsPCR反應中（PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。BSA 72℃保留該類酶的最模板的非特異延dNTP濃度。Mg2+的濃度，所以dNTP濃度200umol/L），濃度高則Tween20(%～%)94℃ 35min。變性95℃），3，端不正確核苷5min，以保證PCR產(chǎn)應等當量。濃度、在PCR基因擴增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺效應。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA的污染等。實驗九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的一、實驗原理不同大小的片段分離位于不同的位置，的片段。有許多型號的低熔點瓊脂糖可在雙鏈DNA的解鏈溫度高于收DNA片段。該法的優(yōu)點是可直接在熔化的凝膠中進行各種酶反應，如合成同位素探針、進行限制酶切割和連接反應等。二、儀器及試劑：電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。：低熔點瓊脂糖、待純化的三、操作步驟：％的瓊脂糖凝膠，在適當?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點瓊脂糖凝膠。，100VDNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中切下目的片段并采用低熔點瓊脂糖回收法即可獲得目65℃時熔化成液體，在65℃，所以可以熔化凝膠而 DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或3830℃時凝固成凝膠。由于DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時回TE（）分離和純化。電泳，觀察所需片段是否移至低熔點膠內(nèi)。， ml離心管中，于70℃熱水中熔化。 GeneQuant 中檢測，確定純度和濃度，其余樣品于20℃保存。四、注意事項：、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈實驗十DNA重組一、實驗原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術之一，其本質(zhì)是一個酶促反應過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接末端，應用更廣泛。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5185。端的磷酸基團上，形成磷酸―磷酸鍵。③鏈3185。端的羥基被活化，取代ATP后與DNA5185。端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和溫度和pH條件下進行連接反應。二、儀器及試劑：：臺式離心機、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。：T4 DNA連接酶、10T4 DNA連接酶緩沖液、載體三、操作步驟DNA5185。端磷酸和3185。端羥基之間相互作T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿3步：①首先，ATP與T4ATP復合物。②被激活的并釋放出ATP作為輔助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重組子。片段的噬菌體取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。10T4 DNA Ligase Buffer ul酶切后的DNA片段*1 pmol酶切后的載體DNA *2T4 DNA LigaseddH2O*1 DNA片段的摩爾數(shù)應控制在載體*2 相同末端的載體與DNA自身環(huán)化。，用手指輕彈Ep℃過夜反應（，片段和酶切DNA片段作電泳。TE將連接混合物稀釋至四、注意事項。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的DNA片段的自身環(huán)化。五、相關問題1ul加至 25ul DNA摩爾數(shù)的3－12～16h）。鑒定連接結(jié)果，50ul，使用10～20ul DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。4010倍。2s 以集中溶液。以未經(jīng)連接的質(zhì)粒 5185。?CDNA片段進行連接時，應首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其管數(shù)次，并于臺式離心機離心轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。磷酸以抑制除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。（1）連接緩沖液的影響不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20100mmol/L的TrisHCl，較多用50mmol/L，，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應；120mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，2550ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應所必需的。（2）pH的影響。有實驗表明，%，那么體系偏堿（）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（）時僅為全部活力的40%。（3）ATP濃度的影響，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，過濃會抑制反應。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報道，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當連接反應失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應于20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。（4）連接溫度與時間的影響因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時間為416h?，F(xiàn)經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，對于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。（5）酶濃度的影響根據(jù)New England Biolabs公司對T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（,末端，此時DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低1020倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個 41 單位/ul），所以進行黏末端連接時需先行稀釋。除了立即用于反應的部分可用酶反應緩沖液稀釋外，其余都應使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。（6）DNA濃度的影響，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。另據(jù)研究，T4 ，所以，連接時DNA濃度不應低于1nmol/L。即應具有2nmol/L的末端濃度。（1）Weiss單位連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量?，F(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。（2）d（AT）環(huán)化單位由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測試溫度高達30℃，與實際連接反應相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(AT)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（AT）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（AT）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。（3）黏性末端單位與Weiss單位相比，d（AT）環(huán)化單位更接近實際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測試中用的是純AT片段，與實際連接中4種堿基隨機排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實際上大多數(shù)連接反應使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,Ⅲ 酶切片段的50%連接上。實驗十一 動物組織細胞總RNA的提取一、實驗原理RNA是基因表達的中間產(chǎn)物，存在于細胞質(zhì)與核中。對中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學實驗所必需的，如雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取質(zhì)變性劑，迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。中進行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制并有助于除去非核酸成分。本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動物組織總二、儀器和試劑：超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80：(1)細胞裂解液：異硫氰酸胍4mol/L檸檬酸鈉（）25mmol/L十二烷基肌氨酸鈉%RNA進行操作在分子生物學NorthernRNA的質(zhì)量。由于細胞RNA時要利用高濃度的蛋白RNA。再通過酚、氯仿等有RNA。在提取的過程中要RNase的環(huán)境