【文章內容簡介】 －60℃的烘箱中也可）（8）沉淀加20μl TE, 反復吹打使質粒四、常見問題及可能原因：變性不充分；關鍵步驟反應時間過短；離心時間或速度不夠。：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內有污染。AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉3～4 h。的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm輕緩上下顛倒離心管以混合內容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。 ml離心 ：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。實驗三瓊脂糖凝膠電泳一、實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應。因而可依據DNA可以分離相對分子質量相同，而構型不同的相對分子質量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在二、儀器及試劑：水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。：50TAE緩沖液的配制：配制1000 mlDNA 片段的常用技術。把DNA樣品加入到一塊包含電解質DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質量標準參照物相對可DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進行檢測?！?0kb范圍內的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝DNA片段分離中的應用方法。凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris乙酸， mol/L EDTA（pH ）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質量的Tris242 g冰乙酸 ml mol/L EDTAml加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。1TAE緩沖液的配制：稱量20 ml的50TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉移到棕色瓶中。室溫保存。6上樣緩沖液：%溴酚藍，%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10 ml溴酚藍mg二甲苯青FFmg甘油ml用6TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。20℃保存。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)： g中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，%瓊脂糖凝膠液。：取電泳槽內的有機玻璃內槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加1TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60－100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。(5）電泳完畢后，取出凝膠， ug/ml的溴化乙錠1TAE用清水漂洗10 min。(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。四、常見問題及注意事項1．配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠。2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。3．電泳時應注意電源線路，預防觸電。4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內使用。5．紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。7．質粒DNA的存在形式有3種，①共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質粒處斷裂而造成。因此質粒DNA電泳的結果中有可能出現三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA 線狀DNA ocDNA。min，再DNA的兩條鏈在同一溶液染色約 DNA18DNA實驗四限制性內切核酸酶的酶切與鑒定一、實驗原理限制性內切酶是一類能識別雙鏈分子中特異核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根據限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學工具酶。限制性內切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現的頻率就越小。許多限制性內切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。5′??GAATTC??3′EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序，形成兩個 和……G這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。限制性內切酶主要用于基因組基因片段的分離與回收以及單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質粒的酶切鑒定，DNA，大量酶切反應用于制備目的基因片段，體積為本實驗為EcoR I對質粒性內切核酸酶酶切位點。瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定酶切效果。二、儀器與試劑：水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、：質粒pUC1EcoR I限制性內切核酸酶、內切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。三、操作步驟3′??……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構建等。根據酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性內切核酸酶對質粒進行酶切反應后，CTT AAG?? 5′5′突出末端：AATTC……EcoR I產生的其它分子末端DNA分子的構建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應和體積為20 μ50～100 μl，DNA在質粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設備等。l, μg 30ug。6上G……根據酶切反應的體積不同，～用量在～分子上有多個限制1． PCR薄壁離心管中進行。（10ul）：酶解緩沖液（10buffer）ul限制性內切酶 ul EcoR I()底物DNA（質粒）滅菌ddH2O限制性內切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后離心15s。37℃水浴消化，分子量標準物同時進行電泳以確定應，或加入適量酶后繼續(xù)反應。，將上述反應液置將剩余酶切產物保存于四、注意事項，所以要充分搖勻。，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干擾反應活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應體系中甘油的質量分數大于12%，以及缺少五、相關問題2h。取5ul酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆谩?0℃，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。NACL和存在Mx ul（依質粒濃度而定）加至10 ul 鑒定酶切反應效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù)65℃水浴中10～15min，中止酶切反應，50%甘油，加入反應管后，因密度較大，往往沉淀至13U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產生所謂星號 206000 r/min，必須用 等情況下，都有可能出現星號活性。不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：TrisHCl（―）：維持穩(wěn)定的pH范圍。50100mmol/LNaCl或KCl：提供一定的離子強度。：1mmol/LDTT：200500ug/ml BSA：度，防止蛋白質分子濃度過低而導致酶分子變性。50%的甘油：15 g/L的Triton100：白質分子的表面變性作用。限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時說明已作用完全，割的最少酶量定為1U的酶量。限制酶切割DNA的反應中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應的溫度、時間與反應的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應條件時才能達到最佳酶切效果。（1）作用溫度早期的酶切反應都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達到每個酶的最適反應溫度。為了達到最佳酶切的效果，最好根據所選用的酶確定所需要的反應溫度。（2）緩沖體系限制酶反應的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：；約絡合掉能激活限制酶的鎂離子。保護酶分子上的還原性基團。牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質的濃使酶液保存于20℃不至凍結。這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激1h內完全切TrisHCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應體系僅根據其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應條件?，F在提供酶的很多廠商能提供410種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。(3)反應體積與時間酶反應體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應體積在加入各種成分時易產生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。常規(guī)的酶切反應一般控制在60min內進行，但也可以根據切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。(4)DNA的純度與濃度除了上述酶反應條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結合在DNA時也會影響酶切效果。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術語稱Smear）時，可肯定系統(tǒng)中已經污染了DNA酶。DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內切酶自身的酶活性情況。除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果。(5)終止酶切反應的方法如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：，原理是絡合掉酶反應中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續(xù)反應。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫 22 30min方能達到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質，特別適用于連續(xù)進行幾個酶切反應；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。實驗五大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化一、實驗原理體外連接的重組DNA分子導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。研究發(fā)現，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉化。細菌處于