病毒分子生物學(xué)鑒定常用技術(shù)(編輯修改稿)
2025-05-01 23:46 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 . . . . .學(xué)習(xí)參考【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】（1）你所做的 PCR 實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照是否出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶 ? 如果有擴(kuò)增帶，請(qǐng)對(duì)你的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述。如果失敗，請(qǐng)分析其原因。 （1）PCR 技術(shù)的基本原理？（2）影響 PCR 實(shí)驗(yàn)成功的因素有哪些？ （3）PCR 檢測(cè)中出現(xiàn)假陽性 ，可能導(dǎo)致的因素有哪些？（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中的體會(huì)，總結(jié)如何做好 PCR 實(shí)驗(yàn)？關(guān)鍵因素有哪些？ 實(shí)驗(yàn) 2 RTPCR 檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸【目的要求】 通過本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分離與 RTPCR 技術(shù)的基本原理、操作方法、影響因素和應(yīng)用。【基本原理】豬繁殖與呼吸綜合征( Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病 毒 ( Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一種傳染病,其臨診特征為各種年齡的豬均可感染,病豬厭食、嗜睡、體溫升高,妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎,種公豬性功能下降,仔豬和育肥豬呼吸障礙。1987年該病首次報(bào)道于美國(guó),隨后迅速蔓延北美、歐洲及亞洲各國(guó),目前已成為一種地方性流行病。1996年初,我國(guó)也報(bào)道了本病的發(fā)生。由于PRRS與其它引起豬繁殖障礙的疾病存在著非常類似的臨診癥狀,根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)診斷很難做出準(zhǔn)確鑒別。實(shí)驗(yàn)室診斷方面,如病毒的分離與鑒定,抗原及抗體的檢測(cè)等方法或特異性、敏感性差,或操作技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn),不能滿足臨床需要。P RRSV屬 動(dòng) 脈 炎 病 毒 科 成 員 ， 有 囊 膜 ， 基 因 組 為 單 股 正 鏈 RNA，大 小 約 15kb。 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction，RTPCR ）方法具有特異、敏感、快速診斷等優(yōu)點(diǎn)，因此P RRSV適 用RTPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。RTPCR 是體外酶促合成特異 DNA 片段的一種方法，它是以 RNA 為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照 RNA 的核苷酸順序合成 DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的 DNA 聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)?；具^程是以 dNTP 為底物，以 RNA 為模板，按 5’→3’方向，合成一條與 RNA 模板互補(bǔ)的 DNA單鏈，這條 DNA 單鏈叫做互補(bǔ) DNA(plementary DNA, cDNA)，它與 RNA 模板形成RNADNA 雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉 RNA 鏈，再以 cDNA 為模板合成第二條 DNA 鏈。至此，完成由 RNA 指導(dǎo)的 DNA 合成 (圖 232)，然后將 DNA 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增的基本原理見實(shí)驗(yàn) 1 部分。. . . . .學(xué)習(xí)參考圖 232 RTPCR 基本原理示意圖【器材準(zhǔn)備】 LS Reagent RNA 提取試劑。、異丙醇、70%乙醇。 處理水：按 1∶1000 的比例將 DEPC 加入三蒸水，室溫放置 12h 以上。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液。Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL） 。 酶抑制劑(40U/μL) 。 mM dNTPs：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 mM。 PCR Buffer、Taq DNA 聚合酶。 分子量標(biāo)準(zhǔn)。：、400g/L 蔗糖水溶液。10mg/ml 溴乙錠(EB)(具致癌性，操作時(shí)應(yīng)戴手套)，瓊脂糖。TAE：242g Tris， 冰乙酸，100mL （）加三蒸水定容到 1000mL。使用液為 1。12. PRRSV 標(biāo) 準(zhǔn) 毒 株 、 PRRSVRNA 可疑組織樣品、P RRSVRNA 陰性組織樣品等。：（1）反轉(zhuǎn)錄引物：可用隨機(jī)引物（Random Primers） （市售） 、Oligo（dT） 1218（市售）或 Random Primers 與 Oligo（dT）按 3：1 混合而成的引物 Oligo（dT ）/Random primer，或用相對(duì) PRRSV RNA 來說的 PCR 下游單側(cè)特異性引物。. . . . .學(xué)習(xí)參考（2）PCR 引物序列： 以 高 度 保 守 的 ORF7 作 為 擴(kuò) 增 靶 區(qū) 設(shè) 計(jì) 并 合 成 一 對(duì) 引 物 ， 序列 如 下 ： 引物 F： 5ATGCCAAATAACAACGGCAAGC； 引物 R： 5TTAATTTGCACCCTGACTG3。：臺(tái)式高速離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、水平式電泳槽、紫外透射反射分析儀、微量加樣器、Eppendorf 管、吸頭與水浴箱等?！緦?shí)驗(yàn)步驟】 （RNA）的分離：病毒核酸（RNA ）分離方法很多，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可靈活考慮。本實(shí)驗(yàn)選擇市售商品化 TRIzol LS Reagent RNA 提取試劑完成豬 呼 吸 與 繁 殖 障 礙 綜 合征 病 毒 (PRRSV)基因組 RNA 的分離。操作按 TRIzol LS Reagent RNA 提取試劑使用說明書進(jìn)行，步驟如下：（1）在 離心管中加入 250μL 的 PRRSV 細(xì) 胞 培養(yǎng)物和 750μL TRIzol LS，蓋上管蓋，倒置混勻，室溫放置 10min。（2）加入 200μL 氯仿，將勻漿劇烈振蕩 15sec，室溫靜置 5min 使核蛋白質(zhì)復(fù)合體徹底裂解。（3）4℃ 12 000 rpm 離心 15min，將上層含 RNA 的水相移入一新管中。為了降低被處于水相和有機(jī)相分界處的 DNA 污染的可能性，不要吸取水相的最下層。（4）加入等體積的異丙醇，充分混勻液體，室溫放置 10min。（5）4℃ 12 000 rpm 離心 15min，棄上清，再用 70%的乙醇洗滌沉淀，然后離心，再用吸頭徹底吸棄上清，在自然條件下干燥沉淀，溶于適量 DEPC 處理的水中。直接用于 RTPCR 或80 ℃貯存，備用。（6）另
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