分子生物學基本實驗操作(編輯修改稿)
2025-02-09 07:33 本頁面
【文章內容簡介】 的 70%乙醇懸浮沉淀， 4℃ ， 12022rpm離心 5min，重復此 步一次； 室溫干燥沉淀 510min，視沉淀多少加入滅菌 ddH2O溶解沉淀 質粒 DNA的質量簽定 一般將質粒 DNA樣品稀釋 100倍，檢測樣品的 OD260和 OD280，計算其比值 R來衡量樣品的純度。一般認為 R≈, DNA質量較好； R＞ ，表明 RNA污 染明顯； R＜ ，表明蛋白質、酚等污染較為明顯。根據 1A260雙鏈 DNA = 50ng/ul，計算質粒 DNA產量。 質檢過關的質粒，若短期內需要進行下一步實驗，可以暫存區(qū) 20℃ ，長期 保存則應置于 80℃ 。做好質粒樣本貯存登記、具體的實驗記錄、質量鑒定 記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。 質粒 DNA的保存 PCR技術 原理 實驗室設置 PCR實驗操作要求在三個不同的區(qū)域內進行，嚴格預防 PCR的污染： 標本處理區(qū)，包括擴增模版的制備； PCR擴增區(qū)，包括 PCR反應液的配置和 PCR擴增； PCR產物分析區(qū)，包括凝膠電泳分析，拍照及膠回收等。 各工作區(qū)必須有一定的隔離，各區(qū)實驗器材需專用，并且各區(qū)設置要有一 定的方向性：標本制備 — PCR擴增 — 產物分析 — 產物處理。 切記 PCR擴增產物及產物分析區(qū)的器材不要拿到標本處理區(qū)和 PCR擴增 區(qū)。 PCR體系及相關參數的設置 10 PCR buffer 5μl dNTP Mix(各 mM) 4μl 引物 P1（ 10 mM） 1μl 引物 P2（ 10 mM） 1μl 模板 * X μl 酶（ 5U/μl） 滅菌雙蒸水 up to 50μl 50μl標準 PCR反應體系 PCR體系及相關參數的設置 50微升標準 PCR反應體系中模板推薦使用量 人基因組 DNA μg 大腸桿菌基因組 DNA 10100 ng 質粒 DNA ng 模板使用量 一般模板復雜程度越高，所需模板量越多，合適的模板量需要摸索 條件 PCR相關參數的設置 (1) 預變性 一般 94℃ 5分鐘； (2) 引物退火 根據所設計的引物來決定，一般為 5570℃ ； (3) 引物延伸 一般在 72℃ 進行，延伸時間視擴增片段長短而定，一般 1Kb需延伸 1min； (4) 循環(huán)中的變性 94℃ ， 30秒足以使各種靶 DNA序列完全變性； (5) 循環(huán)數 大多數 PCR過程含 2535個循環(huán)，過多易產生非特異性擴增； (6) 最后延伸 在最后一個循環(huán)后，一般設置一個 72℃ ， 515min的延伸步驟，使引物延伸 完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。 PCR體系的優(yōu)化 PCR反應條件視模板、引物的結構條件不同而各異，在實際操作中需根據 模板來源、目的片段的大小及堿基組成、引物性質等的具體情況摸索出最佳 反應條件。 （ 1）引物退火溫度 退火溫度是 PCR實驗的一個重要參數，對 PCR的特異性有很大影響。一般根 據所設計引物退火溫度上下 5℃ 來進行梯度實驗，摸索出適合的退火溫度； （ 2）引物濃度 引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在 ，較高的引 物濃度會導致非特異性產物擴增； PCR體系的優(yōu)化 （ 3）鎂離子濃度 可以從 1mM到 3mM，以 ，進行鎂離子濃度梯度實驗； （ 4）循環(huán)參數 在 PCR的前 510個循環(huán)使用嚴緊的退火溫度，使 特異性產物得到優(yōu)先擴 增，然后在一個較低的退火溫度下反應 2030個循 環(huán)；也可以使 PCR反應在 一個高的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低 ℃ 到 2℃ ，直到退火溫度低 于引物設計溫度 5℃ ； PCR體系的優(yōu)化 （ 5）熱啟動 冰上配制 PCR反應液，將其置于預熱的 PCR儀上開始反應；另外還可利用具 有 熱啟動功能的 DNA聚合酶來實現(xiàn)熱啟動； （ 6）巢式 PCR 對于一些較難擴增的模板，可以進行巢式 PCR擴增，以提高特異性和靈敏度。 第一輪是 15到 20個循環(huán)的標準擴增，將擴增所得產物稀釋 100到 1000倍做為模板， 利用巢式引物進行 15到 25個循環(huán)的第二輪擴增。 PCR體系的優(yōu)化 （ 7）其他 對某些結構較為復雜的模板，包括高 GC含量的模板，需要添加一些促進劑以獲 得特異性的 PCR產物，如甲酰胺， DMSO，甘油，甜菜堿等可以增強 PCR的擴增。 為獲得最佳結果，應優(yōu)化添加劑的濃度，一般添
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