【正文】 還的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還有效地克服了有效地克服了 SSLP標(biāo)記中引物設(shè)計(jì)困難的缺點(diǎn)。標(biāo)記中引物設(shè)計(jì)困難的缺點(diǎn)。(9) SSCP(Singlestrand conformation polymorphism) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性 單鏈單鏈 DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于其分子量和空間構(gòu)象。雙鏈分子量和空間構(gòu)象。雙鏈 DNA經(jīng)變性后，再進(jìn)行非變性膠電經(jīng)變性后，再進(jìn)行非變性膠電泳，在非變性膠中，單鏈泳，在非變性膠中，單鏈 DNA可形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)又可形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)又與其堿基序列有關(guān)。通過電泳，不同的單鏈與其堿基序列有關(guān)。通過電泳，不同的單鏈 DNA被分離，單被分離，單鏈鏈 DNA在凝膠中的位置差異反映了其序列組成的差異，從而在凝膠中的位置差異反映了其序列組成的差異，從而呈現(xiàn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性。呈現(xiàn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性。 SSCP可用于檢測(cè)點(diǎn)突變?？捎糜跈z測(cè)點(diǎn)突變。 PCRSSCP是將是將 PCR與與 SSCP相結(jié)合的用于檢測(cè)相結(jié)合的用于檢測(cè) PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 DNA片段中的點(diǎn)突變的技術(shù)，其步驟為，用一對(duì)引物對(duì)基因組片段中的點(diǎn)突變的技術(shù)，其步驟為，用一對(duì)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行擴(kuò)增， PCR產(chǎn)物變性后，再經(jīng)非變性膠電泳，盡而檢產(chǎn)物變性后，再經(jīng)非變性膠電泳，盡而檢測(cè)單鏈點(diǎn)突變。該技術(shù)在人類遺傳病和癌癥的點(diǎn)突變位點(diǎn)的測(cè)單鏈點(diǎn)突變。該技術(shù)在人類遺傳病和癌癥的點(diǎn)突變位點(diǎn)的檢測(cè)中曾發(fā)揮重要作用。檢測(cè)中曾發(fā)揮重要作用。 (10) SNP(Simple nucleotide polymorphism)單核單核苷酸多態(tài)性苷酸多態(tài)性 在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，只涉及到單個(gè)堿基的變異序列的多態(tài)性，只涉及到單個(gè)堿基的變異 (轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換或顛換或顛換 )，也可由堿基的插入或缺失所致。被稱為，也可由堿基的插入或缺失所致。被稱為 第第三代分子遺傳標(biāo)記三代分子遺傳標(biāo)記 。216。 SNP檢測(cè)方法 : 測(cè)序、 RFLP、 SSCP、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交 (ASO)、基因芯片技術(shù)等。 ? PCRSSCP的應(yīng)用舉例的應(yīng)用舉例 PCR擴(kuò)增不同樣本的 DNA片段； PCR產(chǎn)物的變性；非變性凝膠電泳；根據(jù) 單鏈單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)點(diǎn)突變。構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)點(diǎn)突變。216。 SNP技術(shù)的應(yīng)用： 用于構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜；進(jìn)行致病基因以及人類起源、遷移、進(jìn)化的研究；用于家畜遺傳育種研究以及遺傳圖譜和物理圖譜的繪制。 %的一致性，的一致性， ％的差異％的差異 從志愿者身上取得了 DNA樣本，這些志愿者分別是歐洲、非洲和中國人的后裔。 RACE 技術(shù)（ rapid amplification of cDNA ends, cDNA末端的快速擴(kuò)增） RACE是根據(jù)已知序列以 PCR快速擴(kuò)增 cDNA的 5ˊ 和 3ˊ 末端序列的 技術(shù)?？煞譃?3ˊRACE 和 5ˊRACE 兩種 。 3ˊ RACE 和 5ˊ RACE都需先將 mRNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈 cDNA。在 3ˊ RACE 中， cDNA的合成起始于 mRNA的 ploy(A)尾，由含有 oligo(dT)的接頭引物引發(fā)合成第一鏈 cDNA，然后用 3ˊ 錨定引物和一個(gè) 5ˊ 基因特異性引物（ gene specific primer, GSP）進(jìn)行擴(kuò)增，可得到 cDNA的3ˊ 末端序列。在 5ˊ RACE 中，先用一個(gè) GSP引發(fā)第一鏈 cDNA的合成，然后在第一鏈 cDNA的 3ˊ 端加上人工錨定序列，最后用 5ˊ錨定引物和 GSP下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到 cDNA的 5ˊ 末端序列。最后，從 2個(gè)有相互重疊序列的 3ˊ 和 5ˊRACE 產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA，或者通過分析 RACE產(chǎn)物序列，合成相應(yīng)引物 ,再擴(kuò)增出全長(zhǎng) cDNA。 意義：根據(jù)已得到的不完整的 cDNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) mRNA的 3ˊ端和 5ˊ端進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得全長(zhǎng)的 cDNA克隆。 2 基因克隆技術(shù)簡(jiǎn)介5ˊ GACTCGAGTCGACATCGA(T)17 3ˊ Xho I Sal I Cla I Oligo(dT) adaptor primerAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC3’TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’reverse transcriptionPCRAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC3’TTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’GSPadaptor primerAAAAAAAAAA3’TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG5’mRNARE siteRE siteRE sitedigest with restriction enzymes and clone3ˊ RACEGSP1AAAAAAAAAA3’1. reverse transcription3. Anneal primersand do PCRmRNARE site RE sitedigest with restriction enzymes and clone5ˊ capremove RNA and GSP1CCCCC2. terminal transferase+ dCTP3’CCCCC5’GACTCGAGTCGACATCGA(G)173’ Xho I Sal I Cla I5’GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG3’GSP2 CCCCC5’GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGadaptor primer5ˊ RACE 圖位克隆法（ mapbased cloning）與染色體步移（ genomic DNA Walking）(1) 圖位克隆法（ mapbased clonig） ,定位克隆（positional cloning） 首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的 RFLP或 RAPD分子標(biāo)記。其次 ,利用與目的基因最緊密連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。最后 ,根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。 是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。 (a)構(gòu)建起始克隆的限制圖；(b)亞克隆 BH限制片段； (c)用放射性標(biāo)記 BH片段作探針篩選一步克??； (d)構(gòu)建一步克隆的限制圖； (e)亞克隆 HE片段； (f)放射性標(biāo)記 HE片段作探針篩選二步克隆。如此反復(fù)重復(fù)多次，直至獲得目的克隆。圖中 B， E， H分別代表核酸內(nèi)切限制酶 BamHI、 EcoRI和HindⅢ 。RELP克隆 目的基因起始克隆E HB B HB H H E32P(a)(b)(c)(d)(e)32P(f)目的基因克隆多次重復(fù) (a) ~ (c)步驟，逐步逼近目的基因(2) 染色體步移 (chromosome walking) 是根據(jù)已知的 DNA序列得到其側(cè)翼序列的技術(shù)。 用第一個(gè)重組子克隆插入片段中的一段 DNA序列作為探針，（通過雜交法或 PCR法，如反向 PCR）從文庫中篩查第二個(gè)重組子克隆，該克隆插入片段含有與探針重疊的序列和染色體 DNA的其它序列。再用新得的插入片段的末端部分作為探針，去進(jìn)一步篩查文庫。重復(fù)以上操作，得到的插入片段序列長(zhǎng)度逐步延伸，最后可以 “步移 ”到待克隆的 DNA序列。Contigs are linked by sequencing the ends of large DNA fragments謝謝！謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH