分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)操作-文庫吧資料
2025-01-19 07:33本頁面
【正文】 *菌落 PCR一定要建立陰性對照 陽性克隆的簽定 （ 3）將初步確定為陽性的克隆保菌（ 15%甘油），抽質(zhì)粒，送樣測序； （ 4）分析測序結(jié)果，將陽性克隆質(zhì)粒及對應(yīng)的甘油菌編號，貼標(biāo)簽，質(zhì)粒若短期 內(nèi)需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，則可以暫存區(qū) 20℃ ，長期保存則應(yīng)置于 80℃ 。 載體和目的片段的酶切 * 根據(jù)酶的用量及酶切的難易程度選擇合適的酶切時間，一般酶切 23小時；為 酶切完全有時也可以酶切過夜，但要注意防止降解； * 多種酶消化時若緩沖液條件相同，可將酶同時加入；否則，先做低溫或低鹽 的酶切消化，再做高溫或高鹽的酶切消化； * 注意酶的星號活性 克隆步驟 載體和目的片段的連接 （ 1） 無菌離心管中加入合適摩爾比的載體和目的片段，通常載體和目標(biāo)片段 的摩爾比為 1： 210； （ 2） 加入 等體積 的 Solution I連接液 ，混勻， 16℃ 反應(yīng) 60分鐘，一般連接體系 為 10μl； * 連接時間根據(jù)所插入片段的大小以及酶切情況而定。 * 載體酶切好之后，為防止酶切不完全形成自連而影響克隆的篩選，通常需要 一個去磷酸化的處理，用牛小腸堿性磷酸酶（ CIAP）處理載體酶切后的產(chǎn) 物。連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)，篩選陽性克隆。 PCR產(chǎn)物分析 （ 1） PCR所需要的試劑均應(yīng)在紫外滅菌后的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝； （ 2）不能混用 PCR產(chǎn)物分析室的吸頭，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶 膠的污染； （ 3）在打開 PCR反應(yīng)管時應(yīng)避免產(chǎn)物飛濺，如果濺到手套或桌面上，應(yīng)立即更換 手套，并用稀酸擦拭桌面； PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項 PCR的污染非?？膳?，較難消除，尤其是在進(jìn)行大量 PCR實(shí)驗(yàn)的時候更容易發(fā) 生污染，在實(shí)驗(yàn)操作的時候要嚴(yán)格注意以下幾點(diǎn)： （ 4） PCR反應(yīng)較多時，可以將相同組分制備反應(yīng)混合液，然后分裝，這樣 既可以避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； （ 5）必須設(shè)立陰性對照，尤其是在進(jìn)行菌落或者菌液 PCR驗(yàn)證的時候，如 有可能，應(yīng)該也同時建立一個陽性對照，這樣可以驗(yàn)證 PCR反應(yīng)的可 靠性； PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項 （ 6）移液器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本 DNA的污染，最好使用高壓處理的加樣 器，如果不能高溫高壓處理，至少 PCR操作過程中的移液器應(yīng)該專用，尤其 是 PCR產(chǎn)物分析所用的移液器不能拿到標(biāo)本處理區(qū)和 PCR擴(kuò)增區(qū)； （ 7）在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件之前，應(yīng)該注意所剩的 PCR試劑是否足夠完成后續(xù)的實(shí)驗(yàn)， 尤其是反應(yīng) buffer和酶，不能在優(yōu)化好條件之后更換試劑，這樣很可能需重新 摸索條件。 PCR產(chǎn) 物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，最終結(jié)果的確定還需要測序驗(yàn)證。 為獲得最佳結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，一般添加劑的濃度為甘油 5%10％，甲酰 胺 1%5%或者 DMSO 2%10%。 第一輪是 15到 20個循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物稀釋 100到 1000倍做為模板， 利用巢式引物進(jìn)行 15到 25個循環(huán)的第二輪擴(kuò)增。一般根 據(jù)所設(shè)計引物退火溫度上下 5℃ 來進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，摸索出適合的退火溫度； （ 2）引物濃度 引物的濃度會影響特異性。 PCR體系的優(yōu)化 PCR反應(yīng)條件視模板、引物的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù) 模板來源、目的片段的大小及堿基組成、引物性質(zhì)等的具體情況摸索出最佳 反應(yīng)條件。 切記 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物分析區(qū)的器材不要拿到標(biāo)本處理區(qū)和 PCR擴(kuò)增 區(qū)。 質(zhì)粒 DNA的保存 PCR技術(shù) 原理 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置 PCR實(shí)驗(yàn)操作要求在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格預(yù)防 PCR的污染： 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增模版的制備； PCR擴(kuò)增區(qū)，包括 PCR反應(yīng)液的配置和 PCR擴(kuò)增； PCR產(chǎn)物分析區(qū)，包括凝膠電泳分析，拍照及膠回收等。 質(zhì)檢過關(guān)的質(zhì)粒，若短期內(nèi)需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，可以暫存區(qū) 20℃ ，長期 保存則應(yīng)置于 80℃ 。一般認(rèn)為 R≈, DNA質(zhì)量較好； R＞ ，表明 RNA污 染明顯； R＜ ，表明蛋白質(zhì)、酚等污染較為明顯。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì) 胞壁和變性的染色體 DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，被 SDS所包圍，當(dāng)用鉀離子 取代鈉離子時，這些復(fù)合物會從溶液中進(jìn)一步有效地沉淀下來，通過離心去除， 利用異丙醇沉淀從上清中獲得質(zhì)粒 DNA。做好樣本貯存登記、具體的實(shí)驗(yàn)記錄、質(zhì)量鑒定 記錄等，并由專人統(tǒng)一保管。根 據(jù) 1A260雙鏈 DNA=50ng/ul，計算 DNA產(chǎn)量。 DNA質(zhì)量檢測 一般將 DNA樣品稀釋 50100倍（使 OD260值位于 ~），檢測樣品的 OD260， OD280，計算其比值 R來衡量樣品的純度。
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