分子生物學研究法ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 18:09 本頁面
【文章內容簡介】 折疊結構是由單核苷酸序列決定的，當某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。 n 變性梯度凝膠電泳（ denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理 :當雙鏈 DNA在變性梯度凝膠中進行到與 DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。熒光共振能量傳遞(fluorescent resonance energy transfer, FRET) 供者 受者 探針5‘ 3‘Taqman法分子信標 (molecular beacon)法 n 高效液相色譜n ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質譜分析法n DNA芯片技術（ DNA chip） SNP數據庫 n 美國國立生物技術信息中心 n 德國的 HGBAS網站 n n 日本 JST的數據庫 n (gene targeting)n 通過 DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內研究該基因的功能。 (反向遺傳學 )n 基因敲除 (gene knockout)：定向敲除n 基因敲入 (gene knockin)：定向替代基因打靶的必備條件n 胚胎干細胞 (ES細胞 )n 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性n 打靶載體n Neo（新霉素）陽性篩選標志n HSVtk陰性篩選標志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因敲除的基本程序n 打靶載體的構建n 打靶載體導入 ES細胞：重組置換n 基因敲除 ES細胞注射入胚泡n 胚泡植入假孕小鼠的子宮中n 嵌合體的雜交育種基因敲除 Knockoutn 可能會致死 .n Cre/LoxP, FLP / FRT基因敲除的缺點n 能將基因與表型 (生物功能 )聯系起來 ,但不能提供具體的作用機制 。n 對多基因決定的表型無法將其聯系全部找出 。n 操作復雜 ,成本高 .三 .基因克隆技術 (狹義 )獲取目的基因的技術n 1. RACE 技術n 2. cDNA差示顯示法n n n n RACE 技術n Rapid amplification of cDNA ends已知基因一端序列 , 快速獲取另一端序列 .n 5’ RACE (獲取 5’序列 ) 3’ RACE (獲取 3’序列 )n 需要合成引物接頭 (單鏈 DNA), 用 RNA ligase將基因 (RNA)與引物 (DNA)連接 .5’ RACE3’ RACE (非 mRNA擴增 )n 合成兩條互補的引物 , 序列任意 .及一條序列特異的引物n 互補引物中一條 5’標記 Pi, 通過 RNA ligase 將其與 RNA連接 . cDNA差示顯示法 (cDNARDA)n 僅知道生理功能 , 性狀 ,對基因序列一無所知 .獲得該相關基因的方法 .n 原理 : n (sample)與對照 (control)mRNAs被轉錄成 cDNA, 酶切加可PCR擴增接頭 , 擴增后除去接頭 ,只有樣本被加上新接頭 (可 PCR擴增 ).n B. 樣本 (ss)與過量對照 (cc)雜交后 , PCR擴增 . sc被線形擴增 。ss被指數擴增 。 CC不被擴增 . 基因大規(guī)?？寺〖夹g (Gateway 克隆技術 )n 1. 不需要酶切 ,連接 。 n 2. 利用 TOPO反應 ,將 PCR產物克隆到Entry載體 。 再通過 LR反應 , 將基因定點 ,定向重組到表達載體 .n 5’端需要引入 CACC序列 . 酵母雙雜交法（蛋白－蛋白相互作用）n n 一般有 2個功能域（ functional domain）n DNA結合域（ DNAbinding domain）－－ DBDn 轉錄激活域（ transcriptionactivating domain） AD(許多激活子還有二聚體化域 , 有的還有受體結合域 )1. “獵物 ”為一個庫；２．將不同的 “誘餌 ”克隆后，捕獲不同的 “獵物 ”３ .5 酵母單雜交（蛋白核酸相互作用）n
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