分子生物學(xué)研究法ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 18:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當(dāng)某一個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)，便會(huì)直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移率會(huì)發(fā)生改變。 n 變性梯度凝膠電泳（ denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理 :當(dāng)雙鏈 DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與 DNA變性溫度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。熒光共振能量傳遞(fluorescent resonance energy transfer, FRET) 供者 受者 探針5‘ 3‘Taqman法分子信標(biāo) (molecular beacon)法 n 高效液相色譜n ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質(zhì)譜分析法n DNA芯片技術(shù)（ DNA chip） SNP數(shù)據(jù)庫 n 美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 n 德國(guó)的 HGBAS網(wǎng)站 n n 日本 JST的數(shù)據(jù)庫 n (gene targeting)n 通過 DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能。 (反向遺傳學(xué) )n 基因敲除 (gene knockout)：定向敲除n 基因敲入 (gene knockin)：定向替代基因打靶的必備條件n 胚胎干細(xì)胞 (ES細(xì)胞 )n 能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性n 打靶載體n Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志n HSVtk陰性篩選標(biāo)志：?jiǎn)渭儼捳畈《?herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因敲除的基本程序n 打靶載體的構(gòu)建n 打靶載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞：重組置換n 基因敲除 ES細(xì)胞注射入胚泡n 胚泡植入假孕小鼠的子宮中n 嵌合體的雜交育種基因敲除 Knockoutn 可能會(huì)致死 .n Cre/LoxP, FLP / FRT基因敲除的缺點(diǎn)n 能將基因與表型 (生物功能 )聯(lián)系起來 ,但不能提供具體的作用機(jī)制 。n 對(duì)多基因決定的表型無法將其聯(lián)系全部找出 。n 操作復(fù)雜 ,成本高 .三 .基因克隆技術(shù) (狹義 )獲取目的基因的技術(shù)n 1. RACE 技術(shù)n 2. cDNA差示顯示法n n n n RACE 技術(shù)n Rapid amplification of cDNA ends已知基因一端序列 , 快速獲取另一端序列 .n 5’ RACE (獲取 5’序列 ) 3’ RACE (獲取 3’序列 )n 需要合成引物接頭 (單鏈 DNA), 用 RNA ligase將基因 (RNA)與引物 (DNA)連接 .5’ RACE3’ RACE (非 mRNA擴(kuò)增 )n 合成兩條互補(bǔ)的引物 , 序列任意 .及一條序列特異的引物n 互補(bǔ)引物中一條 5’標(biāo)記 Pi, 通過 RNA ligase 將其與 RNA連接 . cDNA差示顯示法 (cDNARDA)n 僅知道生理功能 , 性狀 ,對(duì)基因序列一無所知 .獲得該相關(guān)基因的方法 .n 原理 : n (sample)與對(duì)照 (control)mRNAs被轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 酶切加可PCR擴(kuò)增接頭 , 擴(kuò)增后除去接頭 ,只有樣本被加上新接頭 (可 PCR擴(kuò)增 ).n B. 樣本 (ss)與過量對(duì)照 (cc)雜交后 , PCR擴(kuò)增 . sc被線形擴(kuò)增 。ss被指數(shù)擴(kuò)增 。 CC不被擴(kuò)增 . 基因大規(guī)?？寺〖夹g(shù) (Gateway 克隆技術(shù) )n 1. 不需要酶切 ,連接 。 n 2. 利用 TOPO反應(yīng) ,將 PCR產(chǎn)物克隆到Entry載體 。 再通過 LR反應(yīng) , 將基因定點(diǎn) ,定向重組到表達(dá)載體 .n 5’端需要引入 CACC序列 . 酵母雙雜交法（蛋白－蛋白相互作用）n n 一般有 2個(gè)功能域（ functional domain）n DNA結(jié)合域（ DNAbinding domain）－－ DBDn 轉(zhuǎn)錄激活域（ transcriptionactivating domain） AD(許多激活子還有二聚體化域 , 有的還有受體結(jié)合域 )1. “獵物 ”為一個(gè)庫；２．將不同的 “誘餌 ”克隆后，捕獲不同的 “獵物 ”３ .5 酵母單雜交（蛋白核酸相互作用）n
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