【正文】 PCR。大部分人類基因組測序使用的是BAC克隆。基因組測序計劃 測定某種生物基因組的全部序列。課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號10課題內(nèi)容Analysis and uses of cloned DNA教學時間教學方法講授教學課型理論□ 實驗□ 習題□實踐□ 復習□ 其它□教學手段板書、多媒體教學目的1 了解核酸測序的基本方法2 了解限制圖譜，序列分析，基因組測序計劃3 理解PCR反應(yīng)的原理及操作4 掌握克隆技術(shù)的應(yīng)用重點難點克隆的鑒定、核酸測序、聚合酶鏈式反應(yīng)教　學　內(nèi)　容備　注J1 克隆的鑒定（一般了解）J2 核酸測序DNA 測序 有Maxam 和Gilbert的化學法及Sanger的酶學法RNA 測序 用能切割3/ 端特異核苷酸的RNase來酶解具5/ 端標記的RNA進行序列測定。雜交的mRNA被純化后進行翻譯（雜交釋放翻譯）可鑒定cDNA克隆編碼的蛋白染色體步移 從文庫中分離相鄰基因組的克隆來克隆目的基因為染色體步移。將菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到膜上，將其置入含放射性標志探針溶液中保溫，檢出相應(yīng)克隆。噬菌體λgt11是構(gòu)建表達文庫的最適載體I3 篩選流程篩選 用核酸探針雜交。最后用T4DNA連接酶連接。也可用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow酶延伸引物來合成第二鏈 cDNA末端的處理 先用單鏈特異性核酸酶切掉凸出的3/ 端，再用 Klenow酶補平后加上接頭。 cDNA的合成 用反轉(zhuǎn)錄酶通過向引物（一般為寡聚dT）的3/ 末端添加dNTP來合成 cDNA的第一條鏈。用結(jié)合有寡聚（dT ）的磁珠加到細胞裂解液，在用強磁鐵吸出磁珠并洗出mRNA。cDNA文庫不包括不能轉(zhuǎn)錄的核基因序列文庫大小 計算公式見P140基因組DNA 純化的基因組DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成載體適用的片段（15~25Kb或更大）。思 考 題與 作 業(yè)常用的載體有哪幾類？性質(zhì)、插入片段大小等如何？表達載體與克隆載體的有哪些不同？教學后記學生反應(yīng)內(nèi)容較抽象。轉(zhuǎn)染真核細胞可以采用電穿孔、微注射和固體粒子轟擊。經(jīng)常使用的有黏粒載體、酵母人工染色體和細菌人工染色體等。M13噬菌體在大腸桿菌細胞內(nèi)以雙鏈環(huán)狀形式復制，可以像質(zhì)粒一樣操作，但產(chǎn)生的噬菌體顆粒內(nèi)僅含有環(huán)狀ssDNA。將目的DNA片段連接于侵染所必須的基因的末端，形成重組噬菌體DNA。如用T7表達載體。多克隆位點即具有多個限制酶酶切位點的一段DNA序列，為選擇限制酶或克隆中所使用的酶提供更多的選擇性。當載體分子上具有雙抗生素抗性基因時，就可以用插入片段插入某個抗性基因而使其失活的方式來篩選重組體。篩選的轉(zhuǎn)化子進行增殖保存和分析。重組DNA分子 目的基因插入載體DNA的酶切位點處形成的環(huán)狀分子為重組DNA分子。酶解切割的DNA片段可用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳來分離。G3 限制酶與電泳限制性內(nèi)切核酸酶 細菌含有限制修飾系統(tǒng)，有兩個主要組分：限制性內(nèi)切核酸酶（識別一小段對稱的DNA序列，在識別位點處切割）和甲基化酶（對細胞DNA識別序列內(nèi)的C或A加上一個甲基，保護宿主細胞DNA不被內(nèi)切酶降解）識別序列 限制性內(nèi)切核酸酶僅識別6bp的回文序列，在該位點酶切DNA形成兩個片段，每個片段有5/ 突出末端（帶磷酸基團）和帶游離羥基的3/ 端。用酚抽提法除去殘余蛋白，留在水相中的DNA和RNA可由乙醇沉淀得濃縮并用核糖核酸酶A降解殘余RNA。是常用的載體。篩選含有目的基因的克隆通常用DNA探針經(jīng)雜交來測出，并用限制性酶切圖譜來分析DNA片段。DNA文庫 是一套DNA克隆，它是帶有不同DNA片段的載體在宿主中擴增后的產(chǎn)物。亞克隆 將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體轉(zhuǎn)移的過程為亞克隆 。宿主和載體 載體應(yīng)具有整合特性、獨立復制特性和易被篩選的選擇標志，常用的載體有細菌質(zhì)粒、噬菌體（λ噬菌體和噬菌體M13）和一些病毒，還有人工改造的載體如黏粒、細菌人工染色體、酵母人工染色體等。課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號7課題內(nèi)容Gene manipulation教學時間教學方法講授教學課型理論□ 實驗□ 習題□實踐□ 復習□ 其它□教學手段板書、多媒體教學目的1 了解DNA克隆及常用宿主和載體2 掌握基因組文庫和cDNA文庫3 掌握DNA克隆的一般步驟重點難點DNA克隆策略及其基本方法教　學　內(nèi)　容備　注G1 DNA克隆概述DNA克隆 將生物體基因組DNA片段作為自主復制載體的一部分進行獨立復制，對其進行分離和操作即為DNA克隆。高等真核生物中的一些分散重復序列（如LINES和SINES）很可能是通過轉(zhuǎn)座作用在基因組內(nèi)傳播的。Tn轉(zhuǎn)座子系列除了轉(zhuǎn)座酶，還攜帶其它基因（如抗性基因），其中的β—內(nèi)酰胺酶可使生物體抗青霉素。轉(zhuǎn)座子均有兩個結(jié)構(gòu)特征：兩端有20~40bp的反向重復序列；具有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶催化轉(zhuǎn)座子插入新的位置。這些基因段間的重組產(chǎn)生大量的不同重鏈和輕鏈基因序列，導致抗體種類的多樣化。λ噬菌體編碼的切除酶被激活時，整合作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，λ—DNA脫離細菌基因組。位點特異性重組 非同源DNA的特異片段間的交換，它是在結(jié)合序列部位由特異的酶來催化斷裂重接，而同源重組則是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機斷裂引發(fā)的。大腸桿菌的核酸酶和RecBCD結(jié)合在 chi序列上并產(chǎn)生切口形成單鏈末端，單鏈DNA被 RecA蛋白包裹，4條單鏈形成Holliday結(jié)構(gòu)。單倍體細菌也可重組，如發(fā)生在部分已復制DNA間或染色體DNA與外源DNA（質(zhì)?；蚴删w）間。著色性干皮病（XP）患者缺乏對紫外線引起的大塊DNA損傷的切除功能，對陽光極度敏感，易患皮膚癌F4 重組同源重組 也稱一般重組，即兩個雙螺旋DNA分子間同源序列進行交換。錯配的堿基被MutS和 MutL組合的復合體識別并與之結(jié)合，再與 MutH內(nèi)切核酸酶結(jié)合，后者在子代鏈GATC附近的位點上產(chǎn)生缺刻，啟動對損傷區(qū)的切除修復。它通過堿基的甲基化來實現(xiàn)的。有兩種形式：核苷酸切除修復（，缺口可由DNA聚合酶Ⅰ和連接酶填補）；堿基切除修復（專一的DNA糖基化酶識別修飾堿基，切除修飾堿基與糖基間的N—糖苷鍵，留下一個脫嘌呤或脫嘧啶的AP位點，AP內(nèi)切核酸酶在該位點切開DNA。它也屬于無差錯直接修復。這是一種無差錯的“直接修復”。F3 DNA修復光復活 DNA中的嘧啶二聚體可通過可見光的光解作用而恢復為單體，催化此過程的酶是DNA光解酶（光復活酶）。有些是致死性的，多數(shù)導致間接誘變損傷。許多已改變的堿基會被專一性的DNA糖基化酶所除去，形成無嘌呤和無嘧啶位點或AP位點。原核生物中轉(zhuǎn)移損傷DNA合成屬于對DNA損傷的SOS反應(yīng)（有時也叫“易錯修復”）F2 DNA損傷 堿基的損傷和丟失 DNA的一些損傷是自發(fā)的，如胞嘧啶會自發(fā)水解脫氨變?yōu)槟蜞奏?，它會在接下來的復制中與腺嘌呤配對。烷化劑能在DNA不同位置加上烷基，造成堿基脫落，經(jīng)修復才能防止DNA損傷，細胞對損傷的處理有可能會由于間接誘變而導致突變?；瘜W誘變劑種類很多，堿基類似物可改變堿基配對特性，誘發(fā)直接突變（如5—溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的類似物）。復制忠實性 復制的精確性有3種機制：互補堿基配對原則（模板鏈和進入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點正確配對）；聚合酶的3/→5/外切酶活性有校對功能，它能回走從3/端切掉錯配核苷酸，引物是DNA聚合酶發(fā)揮自我校正功能的必要條件；逃脫校對的錯誤可被錯配修復機制所糾正。一個或多個堿基的增加或丟失，會引起移碼突變。如果點突變發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)、非調(diào)節(jié)區(qū)或密碼子的第3個堿基，它不會影響滲入蛋白質(zhì)中的氨基酸，為沉默突變；如果發(fā)生氨基酸的改變，則為錯義突變。思 考 題與 作 業(yè)什么是半保留機制, 什么是半不連續(xù)復制, 復制的主要過程有哪些?教學后記這個部分是分子生物學的重要章節(jié),要講仔細.課　　時　　教　　案講 授 人查幸福課　　時3序　　號6課題內(nèi)容DNA damage, repair and rebination教學時間教學方法講授教學課型理論□ 實驗□ 習題□實踐□ 復習□ 其它□教學手段板書、多媒體教學目的1 了解突變的種類和產(chǎn)生的因素2 理解DNA復制忠實性的機制3 掌握DNA修復的機制4 掌握DNA重組的方式及原理重點難點DNA突變、修復、重組教　學　內(nèi)　容備　注F1 誘變突變 指DNA堿基序列發(fā)生的永久的可遺傳的改變。端粒酶負責端粒DNA的復制，它帶有與端粒重復序列互補的RNA分子。DNA及復制所需的蛋白質(zhì)均固定在核基質(zhì)上。復制叉 真核生物復制叉移動速度為每秒50bp，該過程需要解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白（復制蛋白A）和3種DNA聚合酶。酵母的起始點都有一個11bp長的保守序列（自動復制序列ARS），它可結(jié)合起始點識別復合體（ORC），被CDK激活后引導DNA復制。非洲爪蟾卵提取物廣泛用于外加DNA或整個細胞核的復制。人類癌癥中兩個重要的抑癌基因產(chǎn)物—抑癌蛋白RB和P53均與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)，RB調(diào)控E2F的活性，當DNA損傷時，P53誘導P21 WAF1/CIP1的合成。細胞周期與癌癥間有著根本的聯(lián)系，G1到S期的過渡受到原癌基因和抑癌蛋白的調(diào)控。E2F和RB的調(diào)控 由G1期進入S期主要依靠對E2F這一轉(zhuǎn)錄因子的激活，E2F的活性又受與其結(jié)合的蛋白RB的抑制，在G1中后期，細胞周期蛋白—CDK復合物使RB磷酸化從而釋放E2F進而激活轉(zhuǎn)錄。細胞周期中終止細胞分裂的那些點叫檢驗點，它在間歇期發(fā)生以保證細胞分裂之前完成DNA復制。有絲分裂后，增殖的細胞進入下一個細胞周期的G1期，也可脫離細胞周期進入非增殖的休眠狀態(tài)G0期（沉默期）。細胞周期分4個時期：G1期—細胞為復制作準備；S期—DNA復制；G2期—S期后有絲分裂前的短暫期；有絲分裂期—染色體對等分配到兩個子細胞，它又有前、中、后期之分。復制結(jié)束后兩個相扣的子鏈DNA由拓撲異構(gòu)酶Ⅳ（一種Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶）解聯(lián)，分配到兩個子細胞。終止與分離 兩個復制叉在 oriC約1800的對面相遇。DNA聚合酶Ⅰ負責切除引物并填補缺口，該酶具有5/ → 3/ 聚合酶、5/ → 3/ 外切核酸酶及3/ →5/校正外切核酸酶活性。引發(fā)體含有 DnaB解旋酶和DNA引物酶，在后續(xù)鏈上間斷合成RNA引物。解旋 DNA解旋酶沿模板鏈前進，打開雙螺旋使復制順利進行，在閉環(huán)DNA中復制叉處解旋所形成的正超螺旋可通過Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶即DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用而釋放。E2 細菌的DNA復制 起始 oriC，大腸桿菌編碼的蛋白 DnaA首先識別和結(jié)合于 oriC的9bp重復序列形成復合物，約45bp成為單鏈， DnaB進入，它是DNA解旋酶，利用ATP水解產(chǎn)生的能量解開雙鏈DNA，形成的單鏈泡被單鏈結(jié)合蛋白 Ssb所覆蓋。即前導鏈連續(xù)合成為長鏈，后隨鏈則是間斷合成的，這種合成方式為半不連續(xù)復制。真核生物的線性染色體由多復制子構(gòu)成，每個復制子都有自己的起始點，起始點在最初解鏈處富含AT序列，它比富含GC的起始點更易解鏈。復制子、復制起始與終點 以單一單位復制的任一段DNA都稱為復制子。DNA合成的底物是脫氧核苷三磷酸（dNTP ）:dATP dGTP 、 dCTP 、 dTTP 。Meselson 和 Stahl (1958年)用實驗證明了該機制（見教材P71）?；蚨鄳B(tài)性 基因或基因座上堿基變化能使該基因座產(chǎn)生多種形式。衛(wèi)星DNA又分小衛(wèi)星DNA（不確定數(shù)目串聯(lián)重復，VNTR）和微衛(wèi)星DNA（簡單串聯(lián)重復，STR），前者出現(xiàn)在染色體末端，后者則平均分布在染色體上。如Alu 元件和L1元件，它們幾乎占了人類基因組的10% 。5個組蛋白基因同在一個基因簇，串聯(lián)重復達數(shù)百次。串聯(lián)基因簇 由串聯(lián)重復的基因或基因簇構(gòu)成中度重復DNA區(qū)段。單一序列DNA 在單倍體基因組中只有一個或幾個拷貝的序列。DNA復性速率可用光譜法（紫外吸收值降低）和羥基磷灰石層析法測量。用剩余單鏈DNA的比例（f)對 C0 t作圖，得到的曲線代表了DNA樣品的復性動力學，即C0 t曲線。這些非編碼DNA大部分由多重拷貝組成，這些拷貝可以是串聯(lián)重復的（如衛(wèi)星DNA）或是分散于基因組中（如分散的Alu元件）。組蛋白變異體和修飾 被包裝的染色質(zhì)的快速變化可通過組蛋白的化學修飾來調(diào)控，如核心組蛋白N端賴氨酸殘基的乙?；欢薪z分裂中染色體的濃縮伴隨著組蛋白H1的磷酸化。CpG 甲基化 哺乳動物DNA中5/—CG—3/序列通常在胞嘧啶堿基處被甲基化，它與染色質(zhì)中的非轉(zhuǎn)錄區(qū)相連。雌性哺乳動物的兩條X染色體都呈異染色質(zhì)狀態(tài)。異染色質(zhì) 是間期染色體內(nèi)保持高度濃縮的部分。端粒是染色體DNA末端特化的 序列，由大量的短重復序列構(gòu)成，由端粒酶合成。D3 真核生物染色體結(jié)構(gòu)有絲分裂染色體 呈高度濃縮狀態(tài)，兩個姐妹染色單體在著絲粒處相連，染色體末端是端粒。30nm纖絲 核小體進一步被組裝成高度有序的左手螺旋（螺線管），即30 nm纖絲，每圈螺旋約6個核小體。在有些細胞中H1可被極度變異的組蛋白H5所取代。H1的功能 H1與核小體結(jié)合，對DNA起穩(wěn)定作用，免受核酸酶的降解。除去H1，剩下與組蛋白八聚體結(jié)合的146bp的核小體核心。核小體 是染色質(zhì)的基本構(gòu)成單位。所有組蛋白帶有大量正電荷，序列中20%—30%由精氨酸和賴氨酸組成，這樣組蛋白與帶負電的DNA緊密結(jié)合。染色質(zhì)是緊密組裝高度有序的DNA—蛋白質(zhì)復合體。RNA聚合酶及mRNA等有助于類核的組構(gòu)。DNA有50—100個環(huán)或結(jié)構(gòu)域，各個結(jié)構(gòu)域可保持不