【正文】 一、遺傳性疾病的診斷例1：鐮狀紅細(xì)胞貧血HBSBeta株蛋白基因突變（點(diǎn)突變,發(fā)生在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP) PCR限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)Southern blot 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是由于b珠蛋白基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致mRNA第6位密碼子GAG突變成GUG，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常(Glu → Val，已知限制酶Mst 1識(shí)別序列，突變后不能識(shí)別，酶切位點(diǎn)消失，限制酶切片段長(zhǎng)度發(fā)生變化。限制性內(nèi)切酶譜分析法( RE )等位基因特異寡核苷酸探針( ASO ) 原理：針對(duì)已知突變位點(diǎn)的基因：可以分別針對(duì)已知突變位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針，其中一條為野生型探針，與無(wú)突變序列互補(bǔ)，另一個(gè)為突變型探針，與突變序列互補(bǔ)。 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又稱為DNA微陣列(DNA Microarray)，是指固定在載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。結(jié)果，內(nèi)切酶位點(diǎn)本身堿基序列雖未改變，但原有內(nèi)切酶位點(diǎn)在基因組中的相對(duì)位置改變了從而導(dǎo)致RFLP。據(jù)此，樣品DNA經(jīng)特定內(nèi)切酶消化或Southern印跡雜交即可診斷某些疾病。該方法主要用于檢測(cè)基因組中待測(cè)的基因或序列Northern 印跡雜交 檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法PCR 基本原理－DNA復(fù)制 167。可檢測(cè)特定基因的存在或表達(dá)情況。斑點(diǎn)印跡雜交 把提取的DNA/RNA樣本，直接點(diǎn)到硝酸纖維膜或尼龍膜上與標(biāo)記核酸探針雜交?？蓽y(cè)知特定基因的存在或表達(dá)狀況。 分子雜交技術(shù)過(guò)程： 探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素） 待測(cè)核酸樣品制備（分離，純化）雜交（液相，固相）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析分子雜交的基本方法 原位雜交 不須提取DNA或RNA。早期診斷：基因診斷不僅可對(duì)有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷，它還可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病，可檢出感染疾病潛伏期的病原微生物、還可預(yù)測(cè)和早期發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤。適應(yīng)性強(qiáng)：其應(yīng)用的范圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域。 特異性高： 以分子雜交技術(shù)為基本原理 靈敏度高： 基因探針帶有十分敏感的檢測(cè)標(biāo)記，可從人類長(zhǎng)達(dá)3106kb的基因組中檢測(cè)出某一基因的單堿基改變。 另外，當(dāng)DNA損傷時(shí)，細(xì)胞表達(dá)p53 mRNA而導(dǎo)致GADD45基因表達(dá)水平升高，使細(xì)胞的生長(zhǎng)停止或凋亡。 GADD45蛋白與CDK3和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合形成復(fù)合體（ CDK3/ GADD45蛋白/PCNA），促進(jìn)DNA修復(fù)。 P53蛋白與復(fù)制因子A相互作用參與DNA的損傷修復(fù)；如果修復(fù)失敗，P53蛋白即啟動(dòng)程序性死亡過(guò)程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，阻止有癌變傾向突變細(xì)胞的產(chǎn)生，從而防止細(xì)胞惡變。 C端300393肽段為p53四聚體結(jié)合部位，該部位除與p53四聚體結(jié)合外，與DNA非特異結(jié)合也有關(guān)。 102292肽段為DNA結(jié)合區(qū)，能與DNA特異序列結(jié)合，結(jié)合時(shí)需要Zn2+參與。 N端1780肽段為酸性區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。 mRNA，編碼生成393個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為53kD。外顯子1不編碼。當(dāng)Rb基因發(fā)生缺失或突變，喪失結(jié)合、抑制E2F的能力，于是細(xì)胞增殖活躍，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。抑癌基因的主要功能：調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制細(xì)胞增殖 誘導(dǎo)終末分化和細(xì)胞凋亡 維持基因穩(wěn)定 抑制蛋白激酶活性 改變DNA甲基化酶活性 調(diào)節(jié)組織蛋白酶活性 Rb基因 位于人13號(hào)染色體q14,全部序列約200 kb,含27個(gè)外顯子, 該mRNA編碼分子量為105kD ,故被稱之為P105蛋白，能與DNA結(jié)合。例如cmyc的激活就有基因擴(kuò)增和基因重排兩種方式，很少見(jiàn)cmyc的突變；而ras的激活方式則主要是突變，各種癌基因之間存在協(xié)同作用,腫瘤的發(fā)生是多步驟，多因素的，不同的癌基因作用于腫瘤發(fā)生的不同階段。 易位后失去原旁側(cè)的抑制性調(diào)節(jié)作用，使其表達(dá)增強(qiáng)?；驍U(kuò)增導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)異常：雙微小染色體，無(wú)著絲粒，4. 染色體易位 原癌基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體正常位置轉(zhuǎn)移到其他某個(gè)位置上稱為染色體易位。雞淋巴細(xì)胞瘤由于白細(xì)胞增生病毒（ALV）的LTR插入 cmyc 的旁側(cè)（5′或3′端），使cmyc的表達(dá)比正常高30100倍 3. 基因擴(kuò)增 基因拷貝數(shù)的增加稱為基因擴(kuò)增。 點(diǎn)突變常見(jiàn)于ras癌基因ras基因的表達(dá)產(chǎn)物RAS是一種小分子G蛋白，在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用， ras基因的點(diǎn)突變主要發(fā)生在第113和61位密碼子，正常RAS的作用因其自身的GTP酶活性而受到嚴(yán)格控制，而突變了的RAS其GTP酶活性下降或喪失，失去了原有控制，致使增殖信號(hào)持續(xù)作用，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。：病毒癌基因表達(dá)蛋白常缺失C 端，轉(zhuǎn)化功能加強(qiáng)。只有在一定的條件下發(fā)生改變而有過(guò)度表達(dá)時(shí)，才可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān),正常狀態(tài)下為非活化形式即原癌基因（proonc）：病毒癌基因轉(zhuǎn)錄效率高；細(xì)胞癌 基因轉(zhuǎn)錄效率低。細(xì)胞癌基因（conc）存在于正常細(xì)胞基因組的癌基因稱為細(xì)胞癌基因（conc）。病毒癌基因 （vonc） 存在于病毒基因組的癌基因稱為病毒癌基因。誘變率極高大引物PCR定點(diǎn)誘變：兩輪PCR，2個(gè)側(cè)翼引物，其中一個(gè)為預(yù)設(shè)突變引物，第一輪PCR后，大引物不需純化，第一輪退火溫度較低，第二輪較高（72℃）特點(diǎn)：簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，平均誘變效率可達(dá)80％第十三章 腫瘤相關(guān)基因癌基因(oncogene，onc.)：是指細(xì)胞或病毒中存在的，能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝。 PCR定點(diǎn)突變重疊延伸PCR誘變：用PCR法各擴(kuò)增兩條帶有預(yù)設(shè)突變堿基的DNA片段，擴(kuò)增的DNA片段在預(yù)設(shè)突變處有重疊區(qū)域，混合重疊片段，并與兩個(gè)原始片段互補(bǔ)的側(cè)翼引物進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，以獲得全長(zhǎng)DNA。硫代磷核苷酸誘變法：限制性核酸內(nèi)切酶 AvaⅠ， AvaⅡ ， BanⅢ， HindⅡ， NciⅠ， PstⅠ，PvuⅠ等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的DNA。Kunkel定點(diǎn)誘變法：通過(guò)篩除含尿嘧啶DNA模板鏈。各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù) 寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變：利用化學(xué)合成的含義突變堿基的寡核苷酸片段作引物，啟動(dòng)單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為新合成DNA子鏈的一個(gè)組成部分，新生成的鏈便已具有突變的堿基序列。 復(fù)等位基因(multiple allele)：位于同一基因位點(diǎn)上的多種等位基因。顯性基因A 。 ★正突變(forward mutation)：顯性基因A232。重演性 相同的基因突變可以在同種生物的不同個(gè)體間重復(fù)發(fā)生，稱為重演性。如果突變的性細(xì)胞參與受精過(guò)程，那么突變基因就會(huì)傳給下一代。體細(xì)胞突變一般不能遺傳給后代。 4．發(fā)生突變的細(xì)胞分類：體細(xì)胞突變: 在保持分裂的身體組織的一個(gè)細(xì)胞發(fā)生突變，這個(gè)細(xì)胞便成為一群相同突變細(xì)胞的祖先。導(dǎo)致一個(gè)特定的生化功能的改變或喪失。如形狀、大小、色澤等的改變。無(wú)義突變：某個(gè)堿基改變使某個(gè)AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子。堿基插入突變 DNA鏈中插入1個(gè)或多個(gè)堿基（轉(zhuǎn)座子Tn），突變后可引起DNA序列閱讀框架改變堿基缺失突變 DNA鏈中1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生丟失，突變后可引起DNA序列閱讀框架改變：同義突變：堿基被替代后沒(méi)有密碼子改變，其產(chǎn)物AA序列也無(wú)變化。第十一章 基因突變基因突變：基因組DNA分子中發(fā)生堿基的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而引起遺傳表型的改變。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA及其重組體導(dǎo)入細(xì)菌；轉(zhuǎn)染：病毒及其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞；轉(zhuǎn)導(dǎo)：噬菌體及其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞。一、 分離或合成外源基因從基因組文庫(kù)中篩選；從cDNA文庫(kù)中篩選；人工合成目的基因；PCR擴(kuò)增目的基因二、 目的基因與載體重組 特定靶基因插入載體DNA，經(jīng)DNA連接酶催化形成嵌合DNA。載體條件：1 必須有自身的復(fù)制子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主地進(jìn)行復(fù)制，并能使靶DNA片段同步擴(kuò)增；2 載體分子上必須有限制性內(nèi)切酶點(diǎn)，以供外源DNA插入，具有多種酶的單一位點(diǎn)，賦予載體在使用上有更大的靈活性；3 應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以便于陽(yáng)性重組體的篩選；4 載體分子本身應(yīng)盡量小，可容納較大的外源DNA片段，并具有拷貝數(shù)高、易與宿主DNA分離及抗剪切力強(qiáng)等特點(diǎn)；5對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。反轉(zhuǎn)錄酶：催化RNA模板反轉(zhuǎn)錄生成DNA產(chǎn)物。DNA聚合酶：催化體外DNA合成。受NFκB調(diào)控的靶基因：TNF, IL, CSF, 免疫受體，粘附因子，趨化因子，急性期蛋白，病毒，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，抗凋亡因子等功能：炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡 第十章 基因克隆基因克?。簩⑷魏紊锇ㄈ说腄NA片段連接在載體如細(xì)菌質(zhì)粒或病毒DNA分子上去，即在體外重組，隨后引入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖的過(guò)程。在這些因子作用下，IκB激酶（IKK）激活，使抑制蛋白磷酸化，后經(jīng)泛素化被降解。 肌球蛋白輕鏈激酶核因子κB (nuclear factor κB )NFκB由Rel家族成員的同源/雜二聚體組成NFκB 的活化機(jī)制 在胞質(zhì)中與其抑制蛋白I κB結(jié)合，并與PKA的催化亞基結(jié)合，呈不具活性狀態(tài)。可被cAMP抑制。 n 與GDP/GTP可逆結(jié)合 位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白 屬于GTPase超家族 雜三聚體 α: 活性亞基，結(jié)合GDP/GTP，結(jié)合受體 GTPase活性(GTP→GDP + Pi) β: 7個(gè)βsheet γ: 2個(gè)αhelixn 構(gòu)象 Inactive: αGDPβγ； Active: αGTP, βγ脫落 信號(hào)傳遞途徑cAMPPKA途徑第一信使 ——R: GPCRs——AC（腺苷酸環(huán)化酶）—— 第二信使：cAMP ——PKA 蛋白激酶A,又稱為cAMP依賴性蛋白激酶，變構(gòu)酶四聚體(R2C2)R2C2: inactive R自身抑制的結(jié)構(gòu)域占據(jù)了C上底物結(jié)合部位 4 cAMP + R2C2(inactive) R2?(4 cAMP) + 2C (active)生物學(xué)效應(yīng) 磷酸化下游靶蛋白（調(diào)節(jié)代謝的關(guān)鍵酶/調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白因子）的Ser/Thr殘基，改變靶蛋白的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的物質(zhì)代謝和基因表達(dá)。單鏈糖蛋白,七個(gè)跨膜α螺旋 N端在細(xì)胞膜外側(cè)，C端在細(xì)胞內(nèi)側(cè)，三個(gè)細(xì)胞外環(huán)，三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)。配體(Ligand):能與受體特異結(jié)合的生物活性分子，如：細(xì)胞間信號(hào)分子、藥物、維生素、毒物。 分類：：內(nèi)分泌信號(hào)(endocrine signal) 特點(diǎn) 由內(nèi)分泌細(xì)胞分泌；通過(guò)血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞 作用時(shí)間較長(zhǎng) ：旁分泌信號(hào)(paracrine signal) 特點(diǎn)：由特定細(xì)胞分泌 通過(guò)擴(kuò)散作用于鄰近的靶細(xì)胞 作用時(shí)間較短 ：突觸分泌信號(hào)(synaptic signal) 特點(diǎn)：由神經(jīng)元突觸前細(xì)胞分泌 通過(guò)突觸間隙到達(dá)突觸后細(xì)胞 作用時(shí)間較短 特點(diǎn) 直接穿越細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞 直接改變效應(yīng)酶的活性 舉例：NO, CO細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子： 第一信使與受體結(jié)合后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的傳遞信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)。 轉(zhuǎn)錄因子：與核心啟動(dòng)子特異結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白。 隔離子：在真核基因組內(nèi)建立獨(dú)立轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件。 終止子：基因編碼區(qū)下游能促使RNAP識(shí)別并終止RNA合成的DNA序列。 啟動(dòng)子：位于基因編碼區(qū)上游并為RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列。很多重要靶基因上游的調(diào)節(jié)蛋白具泛素連接酶活性，尤其很多真核RNA聚合酶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性受E3泛素化和/或蛋白體降解的調(diào)控。（基因表達(dá)）/去乙?；ɑ蜿P(guān)閉） HAT/HDAC、蘇氨酸和酪氨酸羥基上，與負(fù)電荷磷酸基團(tuán)結(jié)合，誘導(dǎo)分子構(gòu)象改變，增加分子間排斥力或吸引力，產(chǎn)生特有的生物學(xué)效應(yīng)。惡性腫瘤伴DNA甲基化總水平降低、多種癌基因伴低甲基化及其轉(zhuǎn)錄激活，或多種抑癌基因伴高甲基化及其轉(zhuǎn)錄抑制。