生物化學分子生物學經(jīng)典實驗技術(shù)(編輯修改稿)
2025-12-04 08:00 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。 。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。 ，接通電源，起始時用的低電流（ 5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出 IPG 膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（或電壓）（ 2030mA/gel/17cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。 ，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并 切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。 。 酵母雙雜交 (一 ) 基本原理 酵母雙雜交系統(tǒng)由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立 i 。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如 GAL GCN等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域 : DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNAbinding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (transcriptionactivating domain)。前者可識別 DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用， 啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體 : a 含 DNA binding domain 的載體 。 b 含 DNAactivating domain 的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達， 其表達產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如 GAL4bd 具有核定位序列(nuclearlocalization sequence)， 而 GAL4ad 沒有。因此， 在 GAL4ad 氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自 SV40 的 T抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用 bindingdomain 基因有： GAL4(1147)。 LexA (E coli 轉(zhuǎn)錄抑制因子 )的 DNAbd 編碼序列。常用的 activatingdomain 基因有： GAL4(768881)和皰疹病毒 VP16 的編碼序列等。 雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因 (reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點 : 〈 1〉 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒?！?2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因?！?3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (如 GAL4bd， LexAbd)； 另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (如 GAL4ad， VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細胞系中， 蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重 建導致相鄰的報道基因表達 (如 lacZ)， 從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用， 具有高度敏感性。主要是由于： ① 采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。 ② 信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。 ③ 雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物而增強， 后者又與啟動子 DNA 結(jié)合， 此三元復合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。 ④ 通過 mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。 同時， 酵母表型 ， XGal及 HIS3 蛋白表達等檢測方法均很敏感。 (二 ) 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 1 特點與優(yōu)點 酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點 : ⑴ 作用信號是在融合基因表達后， 在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 ⑵ 檢測在活細胞內(nèi)進行， 可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。 ⑶ 檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或 暫時的相互作用。 ⑷ 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建 cDNA 文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了 RAP1 與 RIF1ii、 P21cip1 與 CDK2iii、 p16與 CDK4iv等之間的相互作用。 2 結(jié)構(gòu)組成 酵母雙雜交系統(tǒng)可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測定了多種重要結(jié)構(gòu)域， 如 p85 三磷酸肌醇激酶和 p110 亞單位作用的結(jié)構(gòu)域 v， p21cip1 蛋白與增殖細胞膜抗原 (proliferatingcell nuclear antigen， PCNA) 的結(jié)合序列 vi 等。 此外酵母雙雜交系統(tǒng)還應(yīng)用于闡明蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，繪制蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜，在藥物設(shè)計等許多方面。 (三 ) 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的
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