生物化學(xué)分子生物學(xué)經(jīng)典實驗技術(shù)(參考版)
2024-11-02 08:00本頁面
【正文】 綜上所述， RNAi 技術(shù)不僅在黑素瘤、乳腺癌等惡性腫瘤基因治療中有較好的應(yīng)用前景，而且在腫瘤和瘢痕疙瘩治療靶點的高通量篩選過程中有較高的應(yīng)用價值 RNAi 原理示意圖：紫色為正義 RNA段，藍(lán)色為反義 RNA段，綠色為目標(biāo)信使 RNA， dsRNA觸發(fā)了高效的基因沉默機制并極大降低了靶mRNA水平，達(dá)到干擾目的 。剔除 CTGF 表達(dá)可使皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi) I 型和 III 型前膠原蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、組織金屬蛋白酶抑制因子（ tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP） 1， TIMP2 和 TIMP3 等基因表達(dá)水平降低。 瘢痕疙瘩是一種較為難治的疾病，目前尚無有確切療效的治療方法。使用 RNAi 干擾技術(shù)剔除 CXCR4 證實該分子為原位移植腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所必需。使用 RNAi 技術(shù)剔除黑素瘤細(xì)胞的 BRAF 表達(dá)，不僅抑制了腫瘤細(xì)胞生長，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。 3 RNAi 在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景 已證實 NRas 或 BRAF 的激活型突變是引發(fā)黑素瘤的主要病因，其中 66%的病例為 BRAF 激酶作用域突變。同時將抑制序列選擇在特定的位點，可對部分有明確基因突變的惡性腫瘤細(xì)胞如含有 BCL/ABL 或 AML1/MTG8 融合基因的白血病細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用。 RNAi 在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用： RNAi 作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。由于 RNAi 技術(shù)可以利用 siRNA或 siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。闡明人類基因組中功能基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)作用對醫(yī)學(xué)發(fā)展有著深遠(yuǎn)意義。 2020 年， Brummelkamp 等首次使用小鼠 H1 啟動子構(gòu)建了小發(fā)卡 RNA（ small hairpin RNA， shRNA）表達(dá)載體 pSUPER，并證實轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，為利用RNAi 技術(shù)進(jìn)行基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。,539。,539。,539。 2020 年， Wianny和 Svoboda 等分別證實在小鼠胚胎細(xì) 胞和卵母細(xì)胞中 dsRNA能引發(fā) RNAi 效應(yīng)。 1999 年， Hamilton 等首次在 PTGS 植株中發(fā)現(xiàn)了長度為 25nt的 RNA中間產(chǎn)物。直到 1998 年， Fire 等證實 Guo 等發(fā)現(xiàn)的正義 RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄制備的 RNA中污染了微量 dsRNA而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為 RNAi。 1 RNAi 的發(fā)現(xiàn) RNAi 是在研究秀麗新小桿線蟲（ C. elegans）反義 RNA（ antisense RNA）的過程中發(fā)現(xiàn)的，由 dsRNA介導(dǎo)的同源 RNA降解過程。 RNAi 具有生物催化反應(yīng)特征，反應(yīng)中需要多種蛋白因子以及 ATP 參與。 RNA 干擾是基 因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進(jìn)化的高度保守的現(xiàn)象之一。近幾年來 RNAi 研究取得了突破性進(jìn)展，被《 Science》雜志評為 2020 年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列 2020 年十大科學(xué)進(jìn)展之首。隨著噬菌體展示技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其優(yōu)越性被越來越多的實驗室所認(rèn)識，使得該技術(shù)的使用范圍不斷擴展，也使該技術(shù)得以不斷的完善和發(fā)展。用抗體、受體、核酸、以及某些碳水化合物可以從噬菌體隨機肽庫中篩選出與之結(jié)合的肽段，因此在抗原表位分析、分子間相互識別、新型疫苗及藥物的開發(fā)研究方面有廣泛的應(yīng)用前景。因而，哺乳動物雙雜交系統(tǒng)可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段 酵母雙雜交系統(tǒng)建立的基礎(chǔ) 酵母雙 雜交技術(shù)的原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的組成 ?與 BD 融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白 (bait) ?與 AD 融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱靶蛋白 (prey或 fish) ?帶報告基因 (report gene)的宿主細(xì)胞 噬菌體展示 噬菌體展示技術(shù)是 1 種將外源肽或蛋白基因與噬菌體特定蛋白基因在其表面進(jìn)行融合表達(dá)的新技術(shù)。且較酵母雙雜交系統(tǒng)更為快速，在轉(zhuǎn)染 48h 內(nèi)得到結(jié)果。假如兩個融合蛋白相互作用則 cat 報道基因表達(dá)水平明顯增高。表達(dá)這些融合蛋白的 載體與一個報道載體（ CAT）共同轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系。 哺乳動物雙雜交系統(tǒng) viii 也是一種基因水平上以重建轉(zhuǎn)錄因子功能為基礎(chǔ)的體內(nèi)分析方法。其中雙篩選系統(tǒng)用二種不同的報告基因 (常用 lacZ 和 HIS3)有以下優(yōu)勢 vii:⑴ 用不同的啟動子表達(dá)位于酵母二個染色體上的報告基因， 可明顯減少假陽性。 許多研究者對雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用， 使 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。
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