生物化學(xué)分子生物學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)-展示頁(yè)
2024-11-10 08:00本頁(yè)面
【正文】 活組織等 DNA擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。能從 100 萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中， PCR 的靈敏度可達(dá) 3 個(gè) RFU(空斑形成單位 )；在細(xì)菌學(xué)中最小檢 出率為 3 個(gè)細(xì)菌。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。引物與模板的結(jié)合及 引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。近年來以熒光探針為代表的檢測(cè)方法，有逐漸取代電泳法的趨勢(shì) PCR 反應(yīng)特點(diǎn) 特異性強(qiáng) PCR 反應(yīng)的特異性決定因素為： ① 引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合； ② 堿基配對(duì)原則； ③ Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； ④ 靶基因的特異性與保守性。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。 PCR 檢測(cè) PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延 伸， DNA含量既增加一倍。 PCR 反應(yīng)五要素 ： 參加 PCR 反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ PCR 步驟 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR 過程分為三步： （ 90℃ 96℃ ）：雙鏈 DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈 DNA （ 25℃ 65℃ ）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 但是， DNA 聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的 DNA 聚合酶，不僅操 作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了 PCR 技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。 PCR 原理 DNA 的 半保留復(fù)制 是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。隨后 PCR 技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。 Dr. Mullis 并于 1985 年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似 PCR 前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的 酶，但它被廣泛運(yùn)用則于 80 年代之后。 DNA聚合酶 （ DNA polymerase I）最早于 1955 年發(fā)現(xiàn) ，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的 Klenow fragment of E. Coli 則是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性 , 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱 PCR，是一種 分子生物學(xué) 技術(shù)，用于放大 特定的 DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊 DNA復(fù)制?，F(xiàn)今所使用的酶 (簡(jiǎn)稱 Taq polymerase), 則是于 1976 年從 溫泉中的細(xì)菌（ Thermus aquaticus）分離出來的。 PCR 最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的 PCR 則于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 發(fā)展出的， Dr. Mullis 當(dāng)年服務(wù)于 PE 公司，因此 PE 公司在 PCR 界有著特殊的地位。此后， PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。 Mullis 也因此獲得了 1993 年 諾貝爾 化學(xué)獎(jiǎng)。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA 聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。因此，通過溫度變化控制 DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入 DNA聚合酶、 dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 發(fā)現(xiàn)耐熱 DNA聚合同酶 Taq酶對(duì)于 PCR 的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受 90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使 PCR 技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本， PCR 技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。 （ 70℃ 75℃ ）：在 Taq 酶 （在 72℃ 左右最佳的活性）的作用下，以 dNTP 為原料，從引物的 5′端 →3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的 DNA鏈。 現(xiàn)在有些 PCR 因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在 60℃ 65℃ 間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。熒光素（ 溴化乙錠 ， EB）染色凝膠電泳是最最常用的檢測(cè)手段。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法。 其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及 Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合 (復(fù)性 )可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 靈敏度高 PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 (pg=10 12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克 (ug=6)水平。 簡(jiǎn)便、快速 PCR 反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一
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