生物化學(xué)分子生物學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)-資料下載頁
2024-10-29 08:00本頁面
【導(dǎo)讀】可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性的Klenowfragment. 不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。現(xiàn)今所使用的酶,則是于1976年從溫泉。中的細(xì)菌分離出來的。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制的實(shí)驗(yàn)。展出來的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis發(fā)展出的，Dr.Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司。在PCR界有著特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科。研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA. 因此，通過溫度變化控制DNA的變性。量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。
【正文】 此后 dsRNA介導(dǎo)的 RNAi 現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（ posttranscriptional gene silencing， PTGS）、共抑制（ cosuppression）及 RNA介導(dǎo)的病毒抗性、真菌的抑制（ quelling）現(xiàn)象均屬于 RNAi 在不同物種的表現(xiàn)形式。 1999 年， Hamilton 等首次在 PTGS 植株中發(fā)現(xiàn)了長度為 25nt的 RNA中間產(chǎn)物。 2020 年， Zamore和 Hammond 等使用體外培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外源性 dsRNA 通過耗能過程降解成 2123nt 的小干擾 RNA（ small interfering RNA， siRNA）引發(fā) RNAi。 2020 年， Wianny和 Svoboda 等分別證實(shí)在小鼠胚胎細(xì) 胞和卵母細(xì)胞中 dsRNA能引發(fā) RNAi 效應(yīng)。2020 年， Elbashir 等證實(shí) 21nt 的 siRNA可在避免激活 dsRNA依賴的蛋白激酶 (dsRNAdependent protein kinase， PKR)和 239。,539。寡聚腺苷酸合成酶 (239。,539。oligoadenylate synthetase， 239。,539。OAS)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的同時(shí)，有效抑制人胚腎 293 細(xì)胞、 Hela 細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。 2020 年， Brummelkamp 等首次使用小鼠 H1 啟動(dòng)子構(gòu)建了小發(fā)卡 RNA（ small hairpin RNA， shRNA）表達(dá)載體 pSUPER，并證實(shí)轉(zhuǎn)染該載體可有效、特異性地剔除哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，為利用RNAi 技術(shù)進(jìn)行基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。 2 RNAi 的應(yīng)用 RNAi 在探索基因功能中的應(yīng)用：人類基因組計(jì)劃的完成標(biāo)志著后基因組時(shí)代的來臨。闡明人類基因組中功能基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)作用對醫(yī)學(xué)發(fā)展有著深遠(yuǎn)意義。在 RNAi 技術(shù)出現(xiàn)以前，基因敲除（ gene knockout）是主要的反向遺傳學(xué)（ reverse geics）研究手段，但其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、周期長 。由于 RNAi 技術(shù)可以利用 siRNA或 siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段。同時(shí) siRNA 表達(dá)文庫構(gòu)建方法的建立，使得利用 RNAi技術(shù)進(jìn)行高通量篩選成為可能，對闡明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)有重要意義。 RNAi 在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用： RNAi 作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域發(fā)展極為迅速。在利用 RNAi 技術(shù)對 HIV乙型肝炎、丙型肝炎等進(jìn)行基因治療研究中發(fā)現(xiàn)，選擇病毒基 因組中與人類基因組無同源性的序列作為抑制序列可在抑制病毒復(fù)制的同時(shí)避免對正常組織的毒副作用。同時(shí)將抑制序列選擇在特定的位點(diǎn)，可對部分有明確基因突變的惡性腫瘤細(xì)胞如含有 BCL/ABL 或 AML1/MTG8 融合基因的白血病細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用。此外尚可通過使用腫瘤特異性啟動(dòng)子如 hTERT 啟動(dòng)子、 survivin 啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子如酪氨酸酶啟動(dòng)子、骨鈣素啟動(dòng)子引導(dǎo)針對某些癌基因或抗凋亡分子的 siRNA或 shRNA表達(dá)，從而達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。 3 RNAi 在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用前景 已證實(shí) NRas 或 BRAF 的激活型突變是引發(fā)黑素瘤的主要病因，其中 66%的病例為 BRAF 激酶作用域突變。而約 80%的 BRAF突變病例是因胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰试斐傻?599位的纈氨酸突變?yōu)楣劝彼崴隆Ｊ褂?RNAi 技術(shù)剔除黑素瘤細(xì)胞的 BRAF 表達(dá)，不僅抑制了腫瘤細(xì)胞生長，而且減弱了其侵襲能力，為黑素瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。 最近研究表明趨化因子受體 CXCR4 是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因素，其配體 CXCL12 可趨化腫瘤細(xì)胞并調(diào)節(jié)其增生和侵襲特性。使用 RNAi 干擾技術(shù)剔除 CXCR4 證實(shí)該分子為原位移植腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所必需。此外，剔 除 BCRP 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)其介導(dǎo)的腫瘤耐藥。 瘢痕疙瘩是一種較為難治的疾病，目前尚無有確切療效的治療方法。使用特異性 siRNA剔除 TGFβII型受體表達(dá)可以抑制角膜成纖維細(xì)胞表達(dá)纖維粘連蛋白并降低其遷移能力。剔除 CTGF 表達(dá)可使皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi) I 型和 III 型前膠原蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、組織金屬蛋白酶抑制因子（ tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP） 1， TIMP2 和 TIMP3 等基因表達(dá)水平降低。這些結(jié)果提示 TGFβ 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和 CTGF 均可能是瘢 痕疙瘩治療的潛在靶點(diǎn)。 綜上所述， RNAi 技術(shù)不僅在黑素瘤、乳腺癌等惡性腫瘤基因治療中有較好的應(yīng)用前景，而且在腫瘤和瘢痕疙瘩治療靶點(diǎn)的高通量篩選過程中有較高的應(yīng)用價(jià)值 RNAi 原理示意圖：紫色為正義 RNA段，藍(lán)色為反義 RNA段，綠色為目標(biāo)信使 RNA， dsRNA觸發(fā)了高效的基因沉默機(jī)制并極大降低了靶mRNA水平，達(dá)到干擾目的
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