【正文】 5. 色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)是色氨酸生物合成途徑的第一水平調(diào)控，主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)與否6. 第二水平調(diào)控是色氨酸操縱子的弱化系統(tǒng)，決定著已經(jīng)啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄是否能夠進(jìn)行下去色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng)1當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏色氨酸時(shí)，此操縱子開(kāi)放；2而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)合成的色氨酸過(guò)多時(shí)，此操縱子被關(guān)閉3色氨酸作為輔阻遏物衰減子:在原核生物操縱子的操縱區(qū)和結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列原核生物翻譯水平調(diào)控一、翻譯起始的調(diào)控——重疊的密碼子使兩個(gè)基因翻譯偶聯(lián)，保證同一核蛋白體對(duì)重疊基因進(jìn)行連續(xù)翻譯的效率，并使兩個(gè)基因的產(chǎn)物在數(shù)量上保持嚴(yán)格一致——通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)和特定的mRNA (SD序列、AUG及其上、下游部分核苷酸序列)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯二、翻譯的延伸調(diào)控——稀有密碼子三、翻譯水平的終止調(diào)控—基因表達(dá)量與mRNA半衰期成正比—當(dāng)細(xì)菌在缺乏合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸時(shí)，停止合成核蛋白體RNA等的應(yīng)急反應(yīng)真核生物的基因表達(dá)調(diào)控染色質(zhì)水平調(diào)控①活性染色質(zhì):結(jié)構(gòu)松散，基因表達(dá) ★特點(diǎn)1染色質(zhì)DNA對(duì) DNaseⅠ更敏感2正轉(zhuǎn)錄的DNA甲基化程度降低3活潑轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)常常缺乏組蛋白H1，其他核心組蛋白則被乙酰化或與泛素相結(jié)合而修飾4非?；顫姷霓D(zhuǎn)錄區(qū)，如許多真核生物的rRNA基因處，沒(méi)有核小體結(jié)構(gòu)②非活性染色質(zhì):結(jié)構(gòu)緊密，基因不表達(dá)DNA水平的調(diào)控、擴(kuò)增與重排216。 染色質(zhì)的丟失：在細(xì)胞分化過(guò)程中，某些原生動(dòng)物、線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)等體細(xì)胞通過(guò)丟失某些基因而除去這些基因的活性。不可逆216。 基因擴(kuò)增：在細(xì)胞中某些基因的拷貝數(shù)專(zhuān)一性大量增加，并在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿(mǎn)足生長(zhǎng)發(fā)育的需求216。 基因重排：基因改變?cè)瓉?lái)的位置而重新排列組合。216。 DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。216。 甲基化常發(fā)生在基因5′側(cè)區(qū)的CpG序列中，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位的結(jié)合 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控真核生物通過(guò)順式作用元件和反式作用因子相互作用實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控1. 順式作用元件：影響自身基因表達(dá)活性的非編碼DNA序列如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子調(diào)控元件——位于遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)的順式作用元件，包括增強(qiáng)子（正調(diào)控）和沉默子（負(fù)調(diào)控）(1)增強(qiáng)子：遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、決定基因的時(shí)間、空間特異性、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列(2)沉默子：負(fù)性調(diào)節(jié)元件。當(dāng)其DNA序列與特異蛋白因子結(jié)合后，可阻斷轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和活化，使基因表達(dá)的活性受到抑制。功能不受距離和取向的限制應(yīng)答元件:能和專(zhuān)一性蛋白因子結(jié)合，用以調(diào)控真核生物細(xì)胞處于某一特定環(huán)境時(shí)基因表達(dá)的DAN上游序列。反式作用因子★1概念：也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子(TF)，是一類(lèi)細(xì)胞核內(nèi)蛋白因子，通過(guò)與順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性。2分類(lèi)：① 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子—RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組蛋白因子② 特異轉(zhuǎn)錄因子—結(jié)合在轉(zhuǎn)錄核心元件以外的其他上游順式作用元件的蛋白因子，通過(guò)DNA與蛋白之間的相互作用影響轉(zhuǎn)錄的效率★TF的作用特點(diǎn)1同一DNA順式作用元件可被不同的轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別2同一轉(zhuǎn)錄因子可識(shí)別不同的DNA順式作用元件3TF與TF之間存在相互作用4當(dāng)TF與TF；TF與DNA結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致構(gòu)象改變DNA結(jié)合域：通過(guò)核心的DNA結(jié)合基序(motif)識(shí)別雙螺旋DNA的堿基序列，與靶點(diǎn)特異性結(jié)合★四種結(jié)構(gòu)模式① 螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋(HTH) 252。 由兩個(gè)短α螺旋和β轉(zhuǎn)角構(gòu)成252。 通過(guò)識(shí)別螺旋識(shí)別并與DNA大溝結(jié)合252。 也稱(chēng)為同源結(jié)構(gòu)域，參與個(gè)體發(fā)育② 鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger) 252。 一組保守的氨基酸殘基和鋅離子結(jié)合，形成可以進(jìn)入DNA雙螺旋大溝的指狀結(jié)構(gòu)252。 兩種類(lèi)型：Cys2/His2。 Cys2/Cys2③ 亮氨酸拉鏈(bZIP):252。 每隔6個(gè)氨基酸就有一個(gè)亮氨酸殘基252。 以二聚體形式與DNA結(jié)合，兩個(gè)蛋白質(zhì)α螺旋上的亮氨酸靠近而形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)④ 堿性－螺旋環(huán)螺旋(bHLH)：252。 由4050個(gè)氨基酸殘基組成，含有兩個(gè)兩性α螺旋，負(fù)責(zé)二聚體的形成252。 bHLH蛋白含堿性序列，它在HLH基序附近，負(fù)責(zé)結(jié)合DNARNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控1. RNA干擾(RNAi)與基因沉默 ★RNA干擾 概念 過(guò)程① dsRNA的產(chǎn)生② dsRNA被加工成為siRNA③ RISC裝載siRNA④ RISC剪切mRNA2. 微小RNA(miRNA)與RNAimiRNA (microRNA):由高等真核生物基因組編碼、一種小的，類(lèi)似于siRNA的分子。通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。 第八章 基因工程及其在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用★基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過(guò)程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類(lèi)型的技術(shù)原理：將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)四個(gè)要素:工具酶、載體、基因和受體（宿主）細(xì)胞 基因工程的基本過(guò)程1. 目的基因的獲取：從生物體中分離或人工合成 2. 重組載體的構(gòu)建：對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行剪切、修飾，在連接酶的作用下連接形成完整有復(fù)制能力的重組體。 3. 重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞：重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增4. 重組體的篩選與鑒定：直接篩選法(如抗藥標(biāo)志選擇)和免疫學(xué)方法5. 目的基因的表達(dá)及分離純化：原核與真核表達(dá)基因工程相關(guān)酶學(xué)酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ1）合成雙鏈cDNA的第二條鏈；2）缺口平移制作高比活探針 3）DNA序列分析 4）填補(bǔ)3’末端反轉(zhuǎn)錄酶1）合成cDNA 2）替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)、標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸539。羥基末端磷酸化、或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3’羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶Ⅰ型：修飾酶活性和依賴(lài)于ATP的限制性?xún)?nèi)切酶活性 Ⅱ型：內(nèi)切酶活性和修飾酶活性，專(zhuān)一性強(qiáng)。既具有切割位點(diǎn)的專(zhuān)一性, 也具有識(shí)別位點(diǎn)的專(zhuān)一性, 一般在識(shí)別序列內(nèi)切割 Ⅲ型：作用方式同Ⅱ型Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶★①識(shí)別dsDNA中含４8個(gè)相連的堿基對(duì)組成的特定回文序列②斷裂后形成的DNA片段具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端（粘性末端）或平末端DNA連接酶封閉DNA鏈上缺口酶，借助能量催化DNA鏈的5′PO4與另一DNA鏈的3′OH生成磷酸二酯鍵。用于DNA重組和質(zhì)粒的構(gòu)建 1. 大腸桿菌DNA連接酶：只能連接具粘性末端DNA分子，以NAD作輔助因子2. T4 DNA連接酶：連接粘性末端，高濃度可連接平末端，要求3′OH和5′PO4 。催化過(guò)程需要ATP和Mg聚合酶以DNA(RNA)為模板，催化DNA(RNA)的體外合成特點(diǎn)：① 以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA② 需要模板和引物的存在③ 不能起始合成新的DNA鏈④ 催化dNTP加到生長(zhǎng)中的DNA鏈的339。OH末端⑤ 催化DNA合成的方向是539?！?39。 Ⅰ：① 5′→3′的聚合作用② 3 ′→5 ′的外切酶活性③ 5′→3′外切酶活性 聚合酶：① 5′→3′聚合酶活性② 3 ′→5 ′外切酶活性③ 沒(méi)有5′→3′外切酶活性④ 用于填補(bǔ)DNA單鏈末端成為雙鏈 ：無(wú)5′→3′外切酶活性 、需要一條有引物的單鏈DNA作模板 、 3 ′ →5 ′外切酶活性 DNA 聚合酶：★特點(diǎn) ①5′→3′聚合酶活性 ②5′→3′外切酶活性，有鏈置換合成能力③不具有3 ′ →5 ′外切酶活性，沒(méi)有校正功能④良好的熱穩(wěn)定性⑤用于DNA序列分析和PCR反應(yīng)基因工程的載體：可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進(jìn)入適當(dāng)宿主細(xì)胞的DNA分子(克隆載體) 常用的載體:質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)、病毒(virus)★基因工程載體的基本條件1. 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖2. 容易進(jìn)入宿主細(xì)胞3. 有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，容易插入外來(lái)核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制4. 有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志5. 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)質(zhì)粒：獨(dú)立于細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子★質(zhì)粒的特點(diǎn)1. 大多數(shù)質(zhì)粒DNA是是環(huán)狀雙鏈的DNA分子 2. 復(fù)制類(lèi)型分為嚴(yán)緊型和松弛型3. 有共價(jià)閉合環(huán)形、開(kāi)環(huán)和線(xiàn)性三種構(gòu)型4. 泳動(dòng)速度：SCDNA LDNA OCDNA5. 質(zhì)粒具有不相容性6. 具有轉(zhuǎn)移現(xiàn)象和遷移作用l 噬菌體載體216。 特點(diǎn)① 雙鏈DNA分子（線(xiàn)性或環(huán)形）② 兩端具有12個(gè)nt單鏈互補(bǔ)粘性末端③ 具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長(zhǎng)度）④ ⑤ 可克隆15Kb左右的外源基因大容量載體216。 細(xì)菌人工染色體(BACs): F質(zhì)粒，供體DNA300kb,用于大基因組分析216。 P1人工染色體(PACs)：噬菌體P1，需要體外包裝盒轉(zhuǎn)導(dǎo)，供體DNA約100kb,用于大基因組分析216。 酵母人工染色體(YACs)：釀酒酵母著絲粒、端粒和自主復(fù)制序列，供體DNA2000kb,用于大基因組分析和YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物★聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 在體外由引物介導(dǎo)的、酶促快速合成擴(kuò)增特定基因或DNA片段的一種方法?！镌恚涸谶m當(dāng)緩沖液（Mg2+）反應(yīng)體系中，根據(jù)堿基配對(duì)原理利用DNA聚合酶催化和dNTPs的參與下，引物依賴(lài)于DNA模板特性指導(dǎo)DNA合成★基本步驟1. 變性：雙鏈DNA解離成為單鏈(90℃以上)2. 退火(復(fù)性)：引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合（50 ℃ 左右）3. 延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)原則，合成一條新的互補(bǔ)鏈 （70 ℃ 左右）★PCR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+★PCR反應(yīng)的特異性決定因素： 1引物與模板DNA特異正確的結(jié)合 2堿基配對(duì)原則 3Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性 4靶基因的特異性與保守性重組分子引入受體細(xì)胞★1轉(zhuǎn)化(transformation):將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程★2轉(zhuǎn)染(transfection):由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程★3感受態(tài)(petence):細(xì)胞在一定生理狀態(tài)時(shí)可攝取外源性遺傳物質(zhì)，并使受體細(xì)胞產(chǎn)生新的遺傳性狀重組體的鑒定和分析 ★掌握具體方法的名稱(chēng)1. 生物學(xué)方法：表型篩選、抗藥性、缺陷基因的功能互補(bǔ)表型、噬菌斑的變化、報(bào)告基因 2. 免疫學(xué)方法：放免、化學(xué)方法、顯色反應(yīng)3. 核酸雜交法：DNA印記分析Southern、 RNA印記分析 Northern、菌落原位雜交 4. PCR技術(shù)5. 限制性酶切鑒定6. 測(cè)序外源基因的表達(dá)1. 原核表達(dá)體系216。 優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短；可融合表達(dá)216。 缺點(diǎn)：① 缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)克隆cDNA，不宜表達(dá)真核基因組DNA，② 缺乏適當(dāng)?shù)姆g后加工機(jī)制，表達(dá)真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)折疊或進(jìn)行糖基化修飾；③ 很難表達(dá)大量的可溶性蛋白等2. 真核表達(dá)系統(tǒng)216。 優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻譯后修飾與加工216。 缺點(diǎn)：表達(dá)量相對(duì)較低 ，培養(yǎng)周期長(zhǎng)、要求高27 / 27