120301醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-1-資料下載頁
2025-03-08 15:01本頁面
【正文】 解法，將細(xì)菌懸浮于 10％蔗糖溶液中可減輕裂解時對 DNA造成的機(jī)械剪切力。 ? 一些大腸桿菌菌株（如 HB10 TG1等）含較多糖類，用 SDS或煮沸裂解時會大量釋放出來，若隨后用 CsClEB梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時，糖類會很難與質(zhì)粒 DNA區(qū)分開來，而糖類也可抑制多種限制酶的活性。 ? HB101等菌株能表達(dá)核酸內(nèi)切酶 A，且煮沸不能完全滅活，在 Mg2+條件下可以降解質(zhì)粒 DNA， 不建議使用煮沸法 。若一定要使用煮沸法提取該類菌株中的質(zhì)粒 DNA，可采用酚 /氯仿反復(fù)抽提，以除去該酶。 細(xì)菌裂解方法的選擇 強(qiáng)堿破壞堿基配對，使宿主的線狀染色體 DNA解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒 DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒 DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子。 堿裂解法 : 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ? 在 NaOH（ － ）下，用 EDTA 和 SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與 DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒 DNA。 ? 細(xì)胞被裂解后，細(xì)胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng) 狀、 大的復(fù)合物，在 高鹽 條件下可有效沉淀； ? 當(dāng) pH調(diào)至中性時，質(zhì)粒 DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng) 離心 可與染色體 DNA分離 。 ? 使用預(yù)冷 無水乙醇 沉淀上清液中的質(zhì)粒 DNA，再用 70%的乙醇洗滌。 堿裂解法 : 堿裂解法操作步驟 : ? 溶液 Ⅰ （ 50mmol/L葡萄糖， 25mmol/L Tris?Cl()， 10mmol/LEDTA() ? 溶液 Ⅱ （ NaOH， SDS） ? 溶液 Ⅲ （ 乙酸 /乙酸鉀 ） ? 酚 /氯仿 /異戊醇 無水乙醇沉淀 TE液溶解 OD260/280=－ 。 RNA， 堿裂解法 ? 操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。 ? 用于高拷貝質(zhì)粒（如 Xf3或 pUC）的制備其產(chǎn)量一般約為3～ 5μg/ml 菌液；制備量可大可小，是使用最廣泛的方法； ? 制備的質(zhì)粒 DNA可用于 DNA重組、常規(guī)亞克隆、探針標(biāo)記、限制性酶切圖譜繪制以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。 ? 沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)。 煮沸裂解法 ? 將細(xì)菌懸浮于含 TritonX100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX100和溶菌酶能破壞細(xì)胞膜，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與 DNA變性。 ? 質(zhì)粒 DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA，然后回收上清液中的質(zhì)粒 DNA。 ? 條件劇烈， 只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取 。 SDS裂解法 ? 將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA處理以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，再用 SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒 DNA。 ? 條件溫和， 該法特別適用于大質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取 。但有一部分質(zhì)粒 DNA會與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。 一 . 堿裂解法 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ,最廣泛使用 ,適用于所有菌株。 二 . 煮沸裂解法 三 . SDS裂解法 條件溫和，特別適用于大質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取。缺點(diǎn)是產(chǎn)率不高。 條件劇烈，只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的制備。有些菌株不適用。 質(zhì)粒 DNA提取方法的比較 ? 常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒 DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組或轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作。 ? 有些實(shí)驗(yàn)對質(zhì)粒的純度要求更高，如哺乳動物轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動物等實(shí)驗(yàn)，對質(zhì)粒 DNA的閉合環(huán)狀構(gòu)型要求較高，因此需要對提取的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的純化 。 ? 無論用何種方法提取的質(zhì)粒 DNA，都會有不等量的 染色體 DNA和較多RNA、蛋白質(zhì) 殘留其中。 ? 制備的質(zhì)粒也有三種不同 構(gòu)型 ， 即：共價閉合環(huán)狀、線性和半開環(huán)。 質(zhì)粒 DNA的純化 ?去除蛋白質(zhì)、染色體 DNA和 RNA； ?分離質(zhì)粒的不同構(gòu)型； 質(zhì)粒 DNA純化目的 利用質(zhì)粒 DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀兩個性質(zhì) 質(zhì)粒 DNA的純化方法 ? 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心； ? 離子交換層析、凝膠過濾層析； ? 聚乙二醇沉淀法； 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心 ? 利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀 DNA分子的結(jié)合量 不同，導(dǎo)致不同構(gòu)型 DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫梯度中的 浮力密度 有所差異，從而達(dá)到分離純化的目的。 ? 適于純化：①容易帶上切口的特大質(zhì)粒；②用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的閉環(huán)質(zhì)粒；③用于生物物理學(xué)測定的質(zhì)粒。 ? 是 大量制備質(zhì)粒的首選方法 。 ? 缺點(diǎn)：昂貴且費(fèi)時 聚乙二醇沉淀法 ? 利用質(zhì)粒相對較小和共價閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級沉淀的純化方法。 ? 1）用 LiCl（ 強(qiáng)脫水劑，能降低 RNA的溶解度，使蛋白質(zhì)從染色質(zhì)上脫離 ）沉淀粗制品中的大分子 RNA和蛋白質(zhì)，并用 RNase消化小分子 RNA； ? 2）含有 聚乙二醇（ PEG） 的高鹽溶液選擇性地沉淀大的質(zhì)粒 DNA，使小分子 RNA和染色體 DNA片斷留在上清液中； ? 3）沉淀的質(zhì)粒 DNA進(jìn)一步用酚 /氯仿抽提、乙醇沉淀而得到純化。 小分子 RNA與 DNA片段的去除 ? 小分子 RNA與 DNA片段的污染，能夠提供相當(dāng)多的 5’與 3’末端。 ? 利用 DNA末端的酶促反應(yīng)（如末端轉(zhuǎn)移酶、 T4DNA連接酶）和測序反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)很關(guān)鍵。 ? 用 分子篩層析 或 RNase消化等方法去除污染。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH
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