【正文】 黎巴斯德研究所 1902年 1994年 莫諾 Jacques Monod 法國 巴黎巴斯德研究所 1910年 1976年 發(fā)現(xiàn)了酶和病毒的合成的遺傳調(diào)節(jié) 大腸桿菌乳糖操縱子 ★ 基因表達(dá)調(diào)控 雅各布 Fran231。–磷 酸二酯鍵 3?末端 (游離羥基 ) 5?末端 (游離磷酸基 ) DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) ?特征： ①兩條鏈以 反向平行 的方式圍繞同一中心軸向右盤繞 ②主鏈處于螺旋的外側(cè)（核糖 +磷酸） 親水核糖平面與螺旋軸平行 堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)，與中軸垂直 ③螺距： 10bp— — 3600 ?=2nm ④ 大溝與小溝 ： 蛋白質(zhì)識別 DNA的特定遺傳信息的關(guān)鍵點(diǎn) ⑤ 堿基互補(bǔ)配對 A = T,C≡G 核酸變性 ? 在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。 ? 原理 ：核酸在水溶液中以多聚陰陽離子的化合物形式存在，它與 K+、 Na+、 Mg2+、 Li+及 NH4+等陽離子形成的鹽，通過屏蔽帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)使 DNA、 RNA分子聚集在一起而不溶于許多有機(jī)溶劑。 ? 熒光光度法： 用 EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定純度。 ? Tris可使 DNA順利進(jìn)入水相，避免滯留于蛋白層。 細(xì)菌裂解方法的選擇 強(qiáng)堿破壞堿基配對，使宿主的線狀染色體 DNA解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒 DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。 一 . 堿裂解法 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ,最廣泛使用 ,適用于所有菌株。 ? 用 分子篩層析 或 RNase消化等方法去除污染。缺點(diǎn)是產(chǎn)率不高。 堿裂解法 : 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ? 在 NaOH（ － ）下，用 EDTA 和 SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與 DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒 DNA。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 ? 純凈 DNA OD260 / OD280 應(yīng) =；純凈 RNA OD260 / OD280應(yīng) =； ? OD230主要吸收為多肽，苯酚等，純凈的核酸樣品OD260 / OD230 應(yīng) =； ? OD320檢測溶液的懸濁度和其它干擾因子，樣品純凈， OD320應(yīng)接近零， =。 ? 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用 70%～ 75%的乙醇 洗滌 去除。 ? DNA是線狀高分子，粘度很大， 堿性 條件下 穩(wěn)定 ； RNA分子較小，粘度也小，對 酸穩(wěn)定 。 ? 是對人類健康的關(guān)注鼓舞著我，我必須為了人類的健康用盡我所有的努力，這是道義和責(zé)任。 理論 +實(shí)踐 生物大分子 (biomacromolecule) ? 核酸 (nucleic acid ) ? 蛋白質(zhì) (protein) ? 糖復(fù)合物 ? 脂類 生物大分子 (biomacromolecule) ? 核酸 : 核苷酸 （ 堿基，核糖，磷酸 ） DNA RNA (mRNA,tRNA,rRNA, siRNA ,miRNA ……) ?蛋白質(zhì) : 氨基酸 遺傳因子 《基因論》 (1926年 ) 1933年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng) 在一次國際遺傳學(xué)大會(huì)上，有人問他為什么會(huì)有這么多的發(fā)現(xiàn)，摩爾根回答：“一靠 勤奮 、二靠 實(shí)驗(yàn)材料得當(dāng) ，三靠 愿意放棄任何沒有證據(jù)的假說 ，最后還得靠 少開些遺傳學(xué)大會(huì) ”。 ? 核酸 和蛋白質(zhì) 的分離純化是分子生物學(xué) 研究及對疾病進(jìn)行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。 ?破碎細(xì)胞的方法 ： 包括機(jī)械和非機(jī)械法（干燥法，溶胞法）兩大類。 質(zhì)粒 DNA三種構(gòu)型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度（％， W/V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法： 主要通過 A260與 A280的比值來判定有無污染。 核酸的保存 第二節(jié) 真核細(xì)胞基因組 DNA的分離純化 染色體 DNA 去除蛋白質(zhì)、 RNA 生物體組織細(xì)胞 玻棒纏繞法 酚抽提法 基因組 DNA粗品 PFGE分離 特定的 DNA片段 AGE分離 PAGE分離 乙醇沉淀洗滌 基因組 DNA純品 精分離 粗分離 前處理 離子交換層析純化 有機(jī)溶劑抽提 細(xì)胞裂解 蛋白質(zhì)變性沉淀降解 DNA釋放 甲酰胺解聚法 哺乳動(dòng)物基因組 DNA分離純化的一般技術(shù)路線 酚抽提法 ? 1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn) ： 以含 EDTA、 十二烷基磺酸鈉 （ sodium dodecyl sulfate，SDS）及無 DNase的 RNase裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng) 蛋白酶 K（ proteinase K）處理后，用 Tris飽和酚抽提DNA，乙醇沉淀，獲得 DNA粗制品。 ? 一些大腸桿菌菌株（如 HB10 TG1等）含較多糖類，用 SDS或煮沸裂解時(shí)會(huì)大量釋放出來，若隨后用 CsClEB梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)，糖類會(huì)很難與質(zhì)粒 DNA區(qū)分開來，而糖類也可抑制多種限制酶的活性。 SDS裂解法 ? 將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA處理以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，再用 SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚 /氯仿抽提，乙醇沉