120301醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-1-免費(fèi)閱讀
【正文】 ? 1）用 LiCl（ 強(qiáng)脫水劑，能降低 RNA的溶解度，使蛋白質(zhì)從染色質(zhì)上脫離 ）沉淀粗制品中的大分子 RNA和蛋白質(zhì)，并用 RNase消化小分子 RNA； ? 2）含有 聚乙二醇（ PEG） 的高鹽溶液選擇性地沉淀大的質(zhì)粒 DNA，使小分子 RNA和染色體 DNA片斷留在上清液中； ? 3）沉淀的質(zhì)粒 DNA進(jìn)一步用酚 /氯仿抽提、乙醇沉淀而得到純化。 質(zhì)粒 DNA提取方法的比較 ? 常規(guī)小量或中量制備的質(zhì)粒 DNA可用于酶切回收、探針標(biāo)記、重組或轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作。 SDS裂解法 ? 將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA處理以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，再用 SDS裂解去壁細(xì)胞，從而溫和地釋放質(zhì)粒到等滲液中，然后酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒 DNA。 堿裂解法 : 堿裂解法操作步驟 : ? 溶液 Ⅰ （ 50mmol/L葡萄糖， 25mmol/L Tris?Cl()， 10mmol/LEDTA() ? 溶液 Ⅱ （ NaOH， SDS） ? 溶液 Ⅲ （ 乙酸 /乙酸鉀 ） ? 酚 /氯仿 /異戊醇 無(wú)水乙醇沉淀 TE液溶解 OD260/280=－ 。 ? 一些大腸桿菌菌株（如 HB10 TG1等）含較多糖類，用 SDS或煮沸裂解時(shí)會(huì)大量釋放出來(lái)，若隨后用 CsClEB梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)，糖類會(huì)很難與質(zhì)粒 DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)，而糖類也可抑制多種限制酶的活性。 ? 回收率的提高：可通過(guò)提高 DNA樣品的上樣量和選擇適宜的方法與材料而實(shí)現(xiàn)。 核酸的保存 第二節(jié) 真核細(xì)胞基因組 DNA的分離純化 染色體 DNA 去除蛋白質(zhì)、 RNA 生物體組織細(xì)胞 玻棒纏繞法 酚抽提法 基因組 DNA粗品 PFGE分離 特定的 DNA片段 AGE分離 PAGE分離 乙醇沉淀洗滌 基因組 DNA純品 精分離 粗分離 前處理 離子交換層析純化 有機(jī)溶劑抽提 細(xì)胞裂解 蛋白質(zhì)變性沉淀降解 DNA釋放 甲酰胺解聚法 哺乳動(dòng)物基因組 DNA分離純化的一般技術(shù)路線 酚抽提法 ? 1976年創(chuàng)立，經(jīng)改進(jìn) ： 以含 EDTA、 十二烷基磺酸鈉 （ sodium dodecyl sulfate，SDS）及無(wú) DNase的 RNase裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng) 蛋白酶 K（ proteinase K）處理后，用 Tris飽和酚抽提DNA，乙醇沉淀，獲得 DNA粗制品。 ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 質(zhì)粒 DNA三種構(gòu)型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度（％， W/V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法： 主要通過(guò) A260與 A280的比值來(lái)判定有無(wú)污染。 雙鏈 DNA A260=50181。 ?破碎細(xì)胞的方法 ： 包括機(jī)械和非機(jī)械法（干燥法，溶胞法）兩大類?？蓪?duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定量，也可分析純度。 ? 核酸 和蛋白質(zhì) 的分離純化是分子生物學(xué) 研究及對(duì)疾病進(jìn)行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。 霍夫曼和加拿大科學(xué)家拉爾夫 理論 +實(shí)踐 生物大分子 (biomacromolecule) ? 核酸 (nucleic acid ) ? 蛋白質(zhì) (protein) ? 糖復(fù)合物 ? 脂類 生物大分子 (biomacromolecule) ? 核酸 : 核苷酸 （ 堿基，核糖，磷酸 ） DNA RNA (mRNA,tRNA,rRNA, siRNA ,miRNA ……) ?蛋白質(zhì) : 氨基酸 遺傳因子 《基因論》 (1926年 ) 1933年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng) 在一次國(guó)際遺傳學(xué)大會(huì)上，有人問(wèn)他為什么會(huì)有這么多的發(fā)現(xiàn)，摩爾根回答：“一靠 勤奮 、二靠 實(shí)驗(yàn)材料得當(dāng) ，三靠 愿意放棄任何沒(méi)有證據(jù)的假說(shuō) ，最后還得靠 少開(kāi)些遺傳學(xué)大會(huì) ”。 ?? 當(dāng)你翻開(kāi)書(shū)本的時(shí)候，必須盡可能展開(kāi)想象的“翅膀”。 ? 是對(duì)人類健康的關(guān)注鼓舞著我，我必須為了人類的健康用盡我所有的努力，這是道義和責(zé)任。 蛋白芯片等 ； ? 蛋白質(zhì)與核酸相互作用 凝膠滯后實(shí)驗(yàn)；染色體免疫沉淀； DNAaseI足紋分析；Southwestern雜交； ? 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 酵母雙雜交；蛋白質(zhì)免疫共沉淀； 分子生物學(xué)常用技術(shù) The Nobel Prize in Physiology or Medicine： ? 1978年 Arber等 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) ? 2023年 Fire， Mello RNA干擾 ? 2023年 Smith等 基因打靶 The Nobel Prize in Chemistry ： ? 1958年 Sanger 胰島素序列測(cè)定 ? 1980年 Sanger等 雙脫氧鏈終止法測(cè)序 ? 1993年 Mullis 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） M. Smith 寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù) 課程主要內(nèi)容
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