【正文】 １７、 如何選擇攜帶治療基因的載體？答：（二） 選擇攜帶治療基因的載體 治療基因載體能將治療基因攜帶入細(xì)胞內(nèi)，并能阻止細(xì)胞內(nèi)核酸酶對治療基因的降解，還能進(jìn)一步引導(dǎo)治療基因的表達(dá)。 （當(dāng)然，由于導(dǎo)入基因是隨機整合，有可能導(dǎo)致原來正常的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而致一種新的疾病的發(fā)生——基因治療的風(fēng)險性）?；蛘甙l(fā)導(dǎo)入的具有治療作用的DNA片段整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中或獨立于染色體外。藥物的轉(zhuǎn)化快（如麻醉藥）；而另一種多態(tài)性，藥物轉(zhuǎn)化慢。１１、 基因診斷在藥物療效評價中有何應(yīng)用？答：基因診斷技術(shù)能對藥物的療效做出評價。在某些正常人群中，若BRCA或/和BRCA2基因突變頻率較高，可對這些人群做出乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險性預(yù)測。如：新生兒遺傳病篩查、PKV、G6PD缺陷病、β地中海貧血等（P480）。因此，DHPLC需與DNA測序分析連用，故稱為DHPLC——DNA測序分析（6）利用DHPLC——DNA測序分析技術(shù)，能檢測出未知的基因點突變或發(fā)現(xiàn)新的基因突變類型。擴增的所有DNA片段都是一致的。3. 變性高效液相色譜 上述ASO分子雜交，RDB是用于抑制基因點突變的基因診斷。由于被檢測樣品DNA來自PCR擴增產(chǎn)物，故常稱為PCRASO分子雜交2. 反向點雜交（RDB,reverse dot blot） 上述的ASO分子雜交，一次雜交只能檢測一種點突變，但一種遺傳病的基因點突變常有多種類型的突變，就要進(jìn)行很多次ASO分子雜交過程，這就使得操作過程變得很繁瑣。采用跨越斷裂點PCR技術(shù)（GapPCR），就能簡便靈敏的檢測出基因缺失或插入。 3. 目的基因（序列）的PCR擴增。４、 基因診斷用樣品主要有哪些？答：：血液、組織塊、羊水和絨毛、毛發(fā)、精液、唾液、尿液等。 4. 適用性：診斷范圍廣。細(xì)胞凋亡基因有多種，主要有BCl家族，它又分為促凋亡基因及抑凋亡基因。P53蛋白隨時監(jiān)控染色體DNA的完整性，一組DNA遭受損害， P53蛋白將與特定的DNA序列結(jié)合，通過激活P21基因等過程，使DNA得到完全修復(fù)。６、 ＲＢ基因表達(dá)的蛋白質(zhì)是什么？當(dāng)ＲＢ基因發(fā)生缺失突變或　點突變時所產(chǎn)生的病理學(xué)效應(yīng)是什么？答：RB基因定位于染色體1314，有27個外顯子，表達(dá)產(chǎn)物為105kpa的蛋白質(zhì)，屬轉(zhuǎn)錄因子，稱Rb蛋白。經(jīng)信號通路傳遞，引發(fā)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，維持細(xì)胞的正常生長增殖，當(dāng)這些因子過度表達(dá)時，將致細(xì)胞惡性增殖，發(fā)生癌變。由于重組獲得過程中，發(fā)生了一些堿基突變，因此vonc的致癌性較conc要強。 三、進(jìn)一步闡明疾病發(fā)生的分子機制。優(yōu)點： a、表達(dá)蛋白穩(wěn)定，不易受細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶的降解。1 什么是親和篩選法？答：親和篩選法：重組DNA表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，它是抗原或抗體；配體或受體。結(jié)果，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞，在含有Tet的培養(yǎng)基上就能生長。1 借助載體上遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選陽性重組細(xì)胞的方法有哪些？試述之？答：（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：如用質(zhì)粒作為載體構(gòu)建重組體，質(zhì)粒上有AmpR（抗氨芐青霉素基因），當(dāng)這種重組DNA（體）導(dǎo)入細(xì)胞后，這種細(xì)胞對Amp 就有抵抗性，在含有Amp 的培養(yǎng)基上就能生長。平端連接法 目的DNA及載體DNA兩端均為平端時，由DNA連接酶催化將二者連接起來粘—平末端連接法 目的DNA兩端與載體DNA兩端連接時，其中的一端為粘端連接，另一端為平端連接，稱粘—平末端連接法。這種使目的DNA按特定方向插入載體的克隆方法。 PCR法：是目前最常用的方法，根據(jù)目的基因兩端的堿基順序合成一對引物，經(jīng)PCR擴增獲得目的基因。根據(jù)表達(dá)宿主細(xì)胞不同，又分為原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vector）及真核表達(dá)載體（eukaryotic expression vector）。根據(jù)載體功能不同又分為克隆載體（cloning vector）及表達(dá)載體（expression）。 （2）RE的識別酶切部位，具有特殊的堿基順序，通常為46個堿基的回文結(jié)構(gòu)（Palindrome），也稱反向重復(fù)序列。通過自動化微點樣技術(shù)將這些未標(biāo)記的探針依次排列布陣在固相支持載體玻片或尼龍膜上。于是形成各種重組體，將所有這些重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞中（如大腸桿菌），對受體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴增，從而獲得含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體，它可以涵蓋該種生物基因組的全部基因信箱，稱之為基因組DNA文庫。當(dāng)R基團與Q基團分離時，R基團便能產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)這種染料未與DNA結(jié)合處于游離狀態(tài)時，熒光信號強度極低。等位基因特異性寡核苷酸探針分析(PCRASO)： （2）、PCR 擴增突變基因，合成針對突變點的探針，將它與擴增產(chǎn)物雜交，雜交陽性說明有相應(yīng)的基因突變存在。（二）體外基因定點突變 根據(jù)對突變的要求（點突變、缺失突變等）設(shè)計合成相應(yīng)的突變引物，然后進(jìn)行分段PCR擴增，最后將分段擴增產(chǎn)物再融合擴增。另一條引物與另一條模板單鏈的3’端互補結(jié)合。PCR的基本原理 利用DNA半保留復(fù)制的原理結(jié)合體外DNA在不同溫度下變性、復(fù)性的原理建立了高溫變性、低溫復(fù)性、適溫（稱延伸溫度）下合成鏈延伸的三步連續(xù)反應(yīng)的不斷循環(huán)： 1，高溫變性：94℃左右時，雙鏈DNA中兩條單鏈之間氫鍵斷裂，解開成兩條單鏈，便于起模板作用，但又不影響3’，5’磷酸二酯鍵的穩(wěn)定性。 （2）特異蛋白質(zhì)的半定量分析：特異蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白質(zhì)印跡質(zhì)顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)量蛋白質(zhì)比較，經(jīng)掃描方法可進(jìn)行半定量測定。于是，特異性抗體就與NC膜上相應(yīng)的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合成抗原—抗體復(fù)合物。 什么是Northern印跡？有何應(yīng)用？Northern印跡與Southern印跡有何異同？答：RNA印跡（RNA blotting）也稱Northern Blotting，其基本過程及原理與Southern blotting 相同，只是監(jiān)測對象由 DNA換成 RNA。 什么是Southern印跡？有何應(yīng)用？簡述Southern blotting 的基本過程原理？答：DNA印跡（DNA blotting）也稱southern blotting,是 最先發(fā)明使用于檢測DNA，顧稱之。(2) 核酸探針的來源 ① 人工合成：用核酸合成儀按預(yù)定目標(biāo)合成一已知堿基順序的寡核苷酸片段，常用的是DNA片段。2siRNA 對基因表達(dá)有何影響？什么是RNAi？答：siRNA：干擾小RNA是由細(xì)胞內(nèi)的一類雙鏈RNA（dsRNA, doublestranded RNA），在特定條件下，由相應(yīng)酶的酶切作用，產(chǎn)生了特殊序列的小片段dsRNA，長度約2123堿基，稱之為siRNA。如生長因子能增加eIF4E磷酸化，于是翻譯加快，促進(jìn)細(xì)胞生長2舉例說明RNA結(jié)合蛋白對翻譯過程的調(diào)節(jié)？答：RNA結(jié)合蛋白（RBP，RNA birding protein）能與 RNA 特異序列結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)翻譯過程。二個這種結(jié)構(gòu)通過亮氨酸之間的疏水作用結(jié)合成的二聚體，外形如同拉鏈。1轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有哪些？簡述之。1什么是順式作用蛋白調(diào)控？答：基因表達(dá)的某些蛋白產(chǎn)物，能特異識別結(jié)合這個基因自身的順式作用元件（調(diào)控序列），從而調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)，稱之為順式調(diào)節(jié)作用。 （六）真核生物基因信息不僅存在核DNA上，還存在線粒體DNA（mtDNA）上。 Z基因：編碼的酶是β半乳糖苷酶 Y基因：編碼的酶是通透酶 A基因：編碼的酶是乙?；D(zhuǎn)移酶2. 調(diào)控序列：包括 (1) 啟動子（P） (2) 操縱序列（元件）（O） (3) 調(diào)節(jié)基因（I）：I 基因表達(dá)產(chǎn)物阻遏蛋白與O序列結(jié)合，于是，RNA聚合酶不能滑向結(jié)構(gòu)基因，操縱子不能轉(zhuǎn)錄而處于關(guān)閉狀態(tài)。答：操縱子（operon）是原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本單位操縱子結(jié)構(gòu)包括：結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控序列 1. 結(jié)構(gòu)基因：由幾種功能相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)排列而成，常稱之為編碼區(qū)。 上述多層次復(fù)雜調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平，尤其是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)節(jié)是基因表達(dá)最重要的調(diào)控點。 1. 基因調(diào)控（量和結(jié)構(gòu)的調(diào)控） (1) 基因拷貝數(shù)多，表達(dá)產(chǎn)物量也多。如DNA損時，DNA修復(fù)酶基因被誘導(dǎo)激活。因此，基因表達(dá)的空間特異性，也稱基因表達(dá)的組織特異性或細(xì)胞特異性?；虮磉_(dá)就是基因攜帶的遺傳信息表現(xiàn)為表型的過程。多基因家族中，不能表達(dá)蛋白質(zhì)或功能RNA的那個基因，稱之為假基因。1，Alu家族：重復(fù)頻率可達(dá)30~50萬次，Alu家族成員長度約300bp，與6kbp序列間隔排列。衛(wèi)星DNA（satellite DNA） 重復(fù)單位長度一般為2～10bp，呈串聯(lián)狀排列,也稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）在人基因組中約占 5%～6% 。基因家族中有假基因（一個基因家族中，不具備正常功能的家族成員稱假基因。因此，它能進(jìn)行遠(yuǎn)距離調(diào)控。它能被 RNApolⅡ 識別結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA及小分子RNA。內(nèi)含子（intron）：外顯子之間、與mRNA剪接過程中被刪除部分相對應(yīng)的間隔序列。 真核基因的基本結(jié)構(gòu)包括哪些？試述之。答：真核基因的基本結(jié)構(gòu)包括編碼序列及非編碼序列 編碼序列（coding seguence）：包括編碼蛋白質(zhì)及功能RNA（mRNA、rRNA、tRNA、特定小分子RNA）的核苷酸序列。 什么事順式作用元件？其化學(xué)本質(zhì)是什么？順式作用元件主要有哪些？答：非編碼序列對基因表達(dá)起調(diào)控作用，又稱調(diào)控序列。Ⅱ類啟動子結(jié)構(gòu)特征是具有TATA盒。（4）無基因特異性：一種增強子能對任何真核基因發(fā)揮作用，甚至病毒增強子在真核基因中同樣能發(fā)揮作用。后述）。 高度重復(fù)序列的功用： ①參與復(fù)制水平的調(diào)節(jié) ②參與基因表達(dá)調(diào)控 ③參與染色體配對的調(diào)控什么是中度重復(fù)序列？根據(jù)重復(fù)片段長度不同又分為哪兩種類？試述之。約占人基因組的3%～6%。假基因往往缺少內(nèi)含子?；虮磉_(dá)的基本特點（基本規(guī)律）有哪些？答：（一）基因表達(dá)具有時間特異性及空間特異性（二）基因表達(dá)方式的多樣性（三）基因表達(dá)受順式作用元件及反式作用因子的共同調(diào)節(jié)（四）基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)多層次和復(fù)雜性（五）基因表達(dá)調(diào)控是生物體生長和發(fā)育的基礎(chǔ)什么是基因表達(dá)的時間特異性、空間特異性？答：1. 基因表達(dá)具有時間特異性(Temporal specificity):某一特定基因的表達(dá)，是嚴(yán)格按照一定的時間順序發(fā)生的。不同組織細(xì)胞表達(dá)的差異，稱差異性基因表達(dá)。 (2) 阻遏表達(dá)：某些基因，在特定的環(huán)境信號刺激下，其活性被抑制，基因表達(dá)產(chǎn)物減少，這類基因稱為可阻遏基因。某種特定細(xì)胞能選擇性的擴增某個基因，于是，該基因相應(yīng)的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高表達(dá)。原核基因的結(jié)構(gòu)特點有哪些？答：1. 基因組中很少有重復(fù)序列。這些結(jié)構(gòu)基因共同使用一個啟動子及一個轉(zhuǎn)錄終止信號。 (4) CAP結(jié)合位點：位于啟動子上游，CAP結(jié)合該部位后，能增強轉(zhuǎn)錄過程。1染色質(zhì)如何參與基因表達(dá)調(diào)控？答：（一）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，不易轉(zhuǎn)錄，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛，容易轉(zhuǎn)錄。這個具調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)稱為順式作用蛋白1什么是通用轉(zhuǎn)錄因子？什么是特異轉(zhuǎn)錄因子？答：通用轉(zhuǎn)錄因子（general transcription factor）:這類蛋白質(zhì)因子幫助RNApol與啟動子結(jié)合，并起始轉(zhuǎn)錄過程，它們的作用對所有基因的轉(zhuǎn)錄都是必需的。答：(1) 鋅指模體結(jié)構(gòu)(p372)：是一種蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，外形似手指。這個二聚體的N末端富含堿性氨基酸，而顯正電，容易與帶負(fù)電的DNA結(jié)合。如鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（IREBP）（IRE: Iron response element,鐵反應(yīng)元件）與mRNA結(jié)合后，能促進(jìn)ALA合成酶的合成等。這種雙鏈 siRNA參與組成RISC，并能與特異的靶 mRNA互撲結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解，阻斷翻譯過程。 ② 從基因組獲得：用 PCR法擴增基因組中的某個基因片段。其具體過程原理是： (1) 將待測DNA用限制性核酸內(nèi)切酶酶切水解得到大小不同的DNA片段。由于被檢測RNA分子較小，常無需限制性內(nèi)切酶來酶切。（4）用與第一抗體相對應(yīng)的特異性第二抗體，將它進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記或辣根過氧化物酶標(biāo)記或放射性核素標(biāo)記。 什么是斑點印跡（DNA點雜交）？什么是細(xì)胞原位雜交？答：斑點印跡（dot blotting）:將待測DNA或RNA，不需經(jīng)電泳分離直接點樣在NC膜使之呈點狀。此溫度時，單鏈DNA引物自身間的聚合也完全解開，引物便于充分發(fā)揮作用。 引物長度：約1520個核苷酸。于是定點突變（引物）就嵌入到基因組中。1 什么是RT—PCR？什么是原位PCR？答：（一）RT—PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR） RT—PCR（reverse transcription PCR）是將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與 PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。一旦它與雙鏈DNA通過小溝區(qū)域結(jié)合后，熒光信號大大增強，約為游離時的1000倍。③PCR擴增時，DNA鏈合必延長，當(dāng)遇到與模板DNA結(jié)合的探針時，Taq DNApol發(fā)揮5’ 3’核酸外切酶活性，將探針5‘ 端的R基團水解下來，產(chǎn)生熒光。從細(xì)胞（液）中提取mDNA，通過轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的各種cDNA 。將待測樣品DNA（常來自 PCR）進(jìn)行熒光標(biāo)記，與固定在固相支持載體上的各種探針進(jìn)行微雜交，熒光檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描收集熒光信號（熒光共聚焦掃描），經(jīng)計算機軟件進(jìn)行比較分析處理，就可得出檢測結(jié)果。如EcorⅠ的識別順序為： 5’—G A A T T C—3’ 3’—C T T A A G—5’（3）切割方式： 在識別部位，切割DNA雙鏈，產(chǎn)生兩種不同的末端： ① 粘性末端（粘端）：在識別部位對稱的不平齊切開DNA雙鏈，產(chǎn)生單鏈突出的互補粘性