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120301醫(yī)學分子生物學-1-在線瀏覽

2025-04-09 15:01本頁面
  

【正文】 病因?qū)W診斷 基因病 分子診斷 第四代實驗室診斷技術(shù) 限制性酶譜分析 診斷指標的選擇; 診斷結(jié)果的判定; 原位雜交技術(shù)-篩選 21三體(間期) 13號染色體(綠)和 21號染色體(紅)探針與羊水間期細胞雜交,可見兩個綠色信號和三個紅色信號,說明是 21三體。 PCR技術(shù) ;分子雜交 ;分子克隆 ; RNA干擾;基因芯片; DNA測序等 ; ? 蛋白水平 蛋白分離純化; Western Blot。 生物大分子 是指生物體內(nèi)由分子量較低的基本結(jié)構(gòu)單位首尾相連形成的多聚化合物。 ? 核酸 和蛋白質(zhì) 的分離純化是分子生物學 研究及對疾病進行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。 539。 變性 復性 核酸的變性、復性 堿基配對 A= T, C≡G 一級結(jié)構(gòu)不變; 氫鍵; 堿基堆積力; 核酸的變性與復性 變性, 解鏈溫度 或 融解溫度( melting temperature, Tm) 復性, 淬火 ( quench)與 退火( annealing) 50%的 DNA變性 ? 第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則 ? 第二節(jié) 真核細胞基因組 DNA的分離純化 ? 第三節(jié) 質(zhì)粒 DNA的提取與純化 ? 第四節(jié) 真核細胞 RNA的分離純化 一、核酸的分離純化 DNA RNA 核酸的一般理化性質(zhì) ? 多元酸,具較強的酸性。 ? 核酸分子在 機械力 的作用下易發(fā)生斷裂??蓪怂徇M行檢測和定量,也可分析純度。 第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計及原則 ? 核酸分離純化的原則 ? 核酸的釋放 ,核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 核酸的鑒定方法(濃度,純度,完整性) ? 核酸的保存 材料與方法的選擇 ? 臨床診斷與研究常見的標本 —— 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)的細胞。 ? 不影響核酸制品質(zhì)量與產(chǎn)量的前提下,應選安全的試劑與制備方案。 核酸提?。? 溶于水 而 不溶于有機溶劑 的性質(zhì) 保持核酸的完整性(一) ? 盡量 簡化操作步驟 ,減少對核酸的破壞; ? 合適 pH值( pH4- 10) 過酸或過堿 -破壞磷酸二酯鍵 ? 減少 機械剪切力 ,包括劇烈的溶液振蕩、攪拌,使溶液快速通過狹長孔道,細胞突置于低滲溶液中, DNA樣品反復凍融等都可引起 DNA的降解; ? 低溫操作; 保持核酸的完整性(二) ? 抑制核酸酶活性與反應速率,減少對核酸的生物降解: 內(nèi)源或外源的各種 核酸酶 能破壞磷酸二酯鍵; ? DNA酶 的激活需要 Mg2+、 Ca2+等二價金屬離子,可使用二價金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸( ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、 檸檬酸鹽 并在低溫條件下操作,基本可抑制 DNA酶的活性; ? RNA酶 ,分布廣泛,耐高溫、耐酸堿,不易滅活。 ?破碎細胞的方法 : 包括機械和非機械法(干燥法,溶胞法)兩大類。另外還能清除部分雜質(zhì)和某些鹽離子。 核酸的沉淀與洗滌 ? 常用的鹽類 有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂; ? 常用的 有機溶劑 為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法: 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可吸收紫外線,其最大吸收波長為 260nm。 雙鏈 DNA A260=50181。g/ml; 單鏈寡核苷酸 A260=33181。 瓊脂糖凝膠電泳 ---分離、鑒定和提純核酸片段 ? 凝膠中核酸的遷移率: ① 核酸分子的大小 :線性雙鏈 DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。2%100bp) ③ DNA構(gòu)型 :相同分子量的閉環(huán)( Ⅰ 型),開環(huán)( Ⅱ 型)和線狀( Ⅲ 型) DNA,以不同速率通過凝膠。 質(zhì)粒 DNA三種構(gòu)型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度(%, W/V ) DNA分子的有效分離范圍( kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法: 主要通過 A260與 A280的比值來判定有無污染。比值升高與降低均提示不純。 DNA分子較 RNA大得多,電泳遷移率低。 核酸蛋白檢測儀測定: ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳( agarose gel electrophoresis): 可判定核酸制品的完整性。 ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳( agarose gel electrophoresis): 可判定核酸制品的完整性。 RNA電泳鑒定濃度和純度 ~ 5 kb ~ 2 kb ~ ?smear ~ 5 kb ~ 2 kb ~ ?smear RNA電泳 核酸的保存 ? DNA的儲存 DNA溶于 TE緩沖液中在 70℃ 冰箱可保存數(shù)年。在 DNA制品中加入少量氯仿,可以有效避免細菌與霉菌對核酸的污染。 RNA沉淀置無水乙醇中可保留更長時間。 核酸的保存 第二節(jié) 真核細胞基因組 DNA的分離純化 染色體 DNA 去除蛋白質(zhì)、 RNA 生物體組織細胞 玻棒纏繞法 酚抽提法 基因組 DNA粗品 PFGE分離 特定的 DNA片段 AGE分離 PAGE分離 乙醇沉淀洗滌 基因組 DNA純品 精分離
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