120301醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-1-在線瀏覽
2025-04-09 15:01本頁面
【正文】 病因?qū)W診斷 基因病 分子診斷 第四代實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù) 限制性酶譜分析 診斷指標(biāo)的選擇； 診斷結(jié)果的判定； 原位雜交技術(shù)－篩選 21三體（間期） 13號(hào)染色體（綠）和 21號(hào)染色體（紅）探針與羊水間期細(xì)胞雜交，可見兩個(gè)綠色信號(hào)和三個(gè)紅色信號(hào)，說明是 21三體。 PCR技術(shù) ；分子雜交 ；分子克隆 ； RNA干擾；基因芯片； DNA測(cè)序等 ； ? 蛋白水平 蛋白分離純化； Western Blot。 生物大分子 是指生物體內(nèi)由分子量較低的基本結(jié)構(gòu)單位首尾相連形成的多聚化合物。 ? 核酸 和蛋白質(zhì) 的分離純化是分子生物學(xué) 研究及對(duì)疾病進(jìn)行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。 539。 變性 復(fù)性 核酸的變性、復(fù)性 堿基配對(duì) A＝ T， C≡G 一級(jí)結(jié)構(gòu)不變； 氫鍵； 堿基堆積力； 核酸的變性與復(fù)性 變性， 解鏈溫度 或 融解溫度（ melting temperature， Tm） 復(fù)性， 淬火 （ quench）與 退火（ annealing） 50％的 DNA變性 ? 第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則 ? 第二節(jié) 真核細(xì)胞基因組 DNA的分離純化 ? 第三節(jié) 質(zhì)粒 DNA的提取與純化 ? 第四節(jié) 真核細(xì)胞 RNA的分離純化 一、核酸的分離純化 DNA RNA 核酸的一般理化性質(zhì) ? 多元酸，具較強(qiáng)的酸性。 ? 核酸分子在 機(jī)械力 的作用下易發(fā)生斷裂。可對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)和定量，也可分析純度。 第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則 ? 核酸分離純化的原則 ? 核酸的釋放 ,核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 核酸的鑒定方法（濃度，純度，完整性） ? 核酸的保存 材料與方法的選擇 ? 臨床診斷與研究常見的標(biāo)本 —— 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)的細(xì)胞。 ? 不影響核酸制品質(zhì)量與產(chǎn)量的前提下，應(yīng)選安全的試劑與制備方案。 核酸提?。? 溶于水 而 不溶于有機(jī)溶劑 的性質(zhì) 保持核酸的完整性（一） ? 盡量 簡(jiǎn)化操作步驟 ，減少對(duì)核酸的破壞； ? 合適 pH值（ pH4－ 10） 過酸或過堿 －破壞磷酸二酯鍵 ? 減少 機(jī)械剪切力 ，包括劇烈的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速通過狹長(zhǎng)孔道，細(xì)胞突置于低滲溶液中， DNA樣品反復(fù)凍融等都可引起 DNA的降解； ? 低溫操作； 保持核酸的完整性（二） ? 抑制核酸酶活性與反應(yīng)速率，減少對(duì)核酸的生物降解： 內(nèi)源或外源的各種 核酸酶 能破壞磷酸二酯鍵； ? DNA酶 的激活需要 Mg2+、 Ca2+等二價(jià)金屬離子，可使用二價(jià)金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）、 檸檬酸鹽 并在低溫條件下操作，基本可抑制 DNA酶的活性； ? RNA酶 ，分布廣泛，耐高溫、耐酸堿，不易滅活。 ?破碎細(xì)胞的方法 ： 包括機(jī)械和非機(jī)械法（干燥法，溶胞法）兩大類。另外還能清除部分雜質(zhì)和某些鹽離子。 核酸的沉淀與洗滌 ? 常用的鹽類 有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂； ? 常用的 有機(jī)溶劑 為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法： 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可吸收紫外線，其最大吸收波長(zhǎng)為 260nm。 雙鏈 DNA A260=50181。g/ml； 單鏈寡核苷酸 A260=33181。 瓊脂糖凝膠電泳 －－－分離、鑒定和提純核酸片段 ? 凝膠中核酸的遷移率： ① 核酸分子的大小 ：線性雙鏈 DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比。2%100bp) ③ DNA構(gòu)型 ：相同分子量的閉環(huán)（ Ⅰ 型），開環(huán)（ Ⅱ 型）和線狀（ Ⅲ 型） DNA，以不同速率通過凝膠。 質(zhì)粒 DNA三種構(gòu)型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度（％， W/V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法： 主要通過 A260與 A280的比值來判定有無污染。比值升高與降低均提示不純。 DNA分子較 RNA大得多，電泳遷移率低。 核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定： ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 RNA電泳鑒定濃度和純度 ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear RNA電泳 核酸的保存 ? DNA的儲(chǔ)存 DNA溶于 TE緩沖液中在 70℃ 冰箱可保存數(shù)年。在 DNA制品中加入少量氯仿，可以有效避免細(xì)菌與霉菌對(duì)核酸的污染。 RNA沉淀置無水乙醇中可保留更長(zhǎng)時(shí)間。 核酸的保存 第二節(jié) 真核細(xì)胞基因組 DNA的分離純化 染色體 DNA 去除蛋白質(zhì)、 RNA 生物體組織細(xì)胞 玻棒纏繞法 酚抽提法 基因組 DNA粗品 PFGE分離 特定的 DNA片段 AGE分離 PAGE分離 乙醇沉淀洗滌 基因組 DNA純品 精分離
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