120301醫(yī)學分子生物學-1-在線瀏覽
2025-04-09 15:01本頁面
【正文】 病因學診斷 基因病 分子診斷 第四代實驗室診斷技術 限制性酶譜分析 診斷指標的選擇； 診斷結果的判定； 原位雜交技術－篩選 21三體（間期） 13號染色體（綠）和 21號染色體（紅）探針與羊水間期細胞雜交，可見兩個綠色信號和三個紅色信號，說明是 21三體。 PCR技術 ；分子雜交 ；分子克隆 ； RNA干擾；基因芯片； DNA測序等 ； ? 蛋白水平 蛋白分離純化； Western Blot。 生物大分子 是指生物體內由分子量較低的基本結構單位首尾相連形成的多聚化合物。 ? 核酸 和蛋白質 的分離純化是分子生物學 研究及對疾病進行分子診斷的最基礎工作。 539。 變性 復性 核酸的變性、復性 堿基配對 A＝ T， C≡G 一級結構不變； 氫鍵； 堿基堆積力； 核酸的變性與復性 變性， 解鏈溫度 或 融解溫度（ melting temperature， Tm） 復性， 淬火 （ quench）與 退火（ annealing） 50％的 DNA變性 ? 第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則 ? 第二節(jié) 真核細胞基因組 DNA的分離純化 ? 第三節(jié) 質粒 DNA的提取與純化 ? 第四節(jié) 真核細胞 RNA的分離純化 一、核酸的分離純化 DNA RNA 核酸的一般理化性質 ? 多元酸，具較強的酸性。 ? 核酸分子在 機械力 的作用下易發(fā)生斷裂?？蓪怂徇M行檢測和定量，也可分析純度。 第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則 ? 核酸分離純化的原則 ? 核酸的釋放 ,核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 核酸的鑒定方法（濃度，純度，完整性） ? 核酸的保存 材料與方法的選擇 ? 臨床診斷與研究常見的標本 —— 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)的細胞。 ? 不影響核酸制品質量與產量的前提下，應選安全的試劑與制備方案。 核酸提?。? 溶于水 而 不溶于有機溶劑 的性質 保持核酸的完整性（一） ? 盡量 簡化操作步驟 ，減少對核酸的破壞； ? 合適 pH值（ pH4－ 10） 過酸或過堿 －破壞磷酸二酯鍵 ? 減少 機械剪切力 ，包括劇烈的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速通過狹長孔道，細胞突置于低滲溶液中， DNA樣品反復凍融等都可引起 DNA的降解； ? 低溫操作； 保持核酸的完整性（二） ? 抑制核酸酶活性與反應速率，減少對核酸的生物降解： 內源或外源的各種 核酸酶 能破壞磷酸二酯鍵； ? DNA酶 的激活需要 Mg2+、 Ca2+等二價金屬離子，可使用二價金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）、 檸檬酸鹽 并在低溫條件下操作，基本可抑制 DNA酶的活性； ? RNA酶 ，分布廣泛，耐高溫、耐酸堿，不易滅活。 ?破碎細胞的方法 ： 包括機械和非機械法（干燥法，溶胞法）兩大類。另外還能清除部分雜質和某些鹽離子。 核酸的沉淀與洗滌 ? 常用的鹽類 有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂； ? 常用的 有機溶劑 為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法： 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可吸收紫外線，其最大吸收波長為 260nm。 雙鏈 DNA A260=50181。g/ml； 單鏈寡核苷酸 A260=33181。 瓊脂糖凝膠電泳 －－－分離、鑒定和提純核酸片段 ? 凝膠中核酸的遷移率： ① 核酸分子的大小 ：線性雙鏈 DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。2%100bp) ③ DNA構型 ：相同分子量的閉環(huán)（ Ⅰ 型），開環(huán)（ Ⅱ 型）和線狀（ Ⅲ 型） DNA，以不同速率通過凝膠。 質粒 DNA三種構型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度（％， W/V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法： 主要通過 A260與 A280的比值來判定有無污染。比值升高與降低均提示不純。 DNA分子較 RNA大得多，電泳遷移率低。 核酸蛋白檢測儀測定： ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 RNA電泳鑒定濃度和純度 ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear RNA電泳 核酸的保存 ? DNA的儲存 DNA溶于 TE緩沖液中在 70℃ 冰箱可保存數(shù)年。在 DNA制品中加入少量氯仿，可以有效避免細菌與霉菌對核酸的污染。 RNA沉淀置無水乙醇中可保留更長時間。 核酸的保存 第二節(jié) 真核細胞基因組 DNA的分離純化 染色體 DNA 去除蛋白質、 RNA 生物體組織細胞 玻棒纏繞法 酚抽提法 基因組 DNA粗品 PFGE分離 特定的 DNA片段 AGE分離 PAGE分離 乙醇沉淀洗滌 基因組 DNA純品 精分離
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