120301醫(yī)學分子生物學-1-wenkub.com
2025-03-06 15:01 本頁面
【正文】 ? 利用 DNA末端的酶促反應（如末端轉(zhuǎn)移酶、 T4DNA連接酶）和測序反應等實驗很關(guān)鍵。 ? 是 大量制備質(zhì)粒的首選方法 。 ? 無論用何種方法提取的質(zhì)粒 DNA，都會有不等量的 染色體 DNA和較多RNA、蛋白質(zhì) 殘留其中。 條件劇烈，只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的制備。但有一部分質(zhì)粒 DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA，然后回收上清液中的質(zhì)粒 DNA。 ? 用于高拷貝質(zhì)粒（如 Xf3或 pUC）的制備其產(chǎn)量一般約為3～ 5μg/ml 菌液；制備量可大可小，是使用最廣泛的方法； ? 制備的質(zhì)粒 DNA可用于 DNA重組、常規(guī)亞克隆、探針標記、限制性酶切圖譜繪制以及細菌轉(zhuǎn)化等實驗。 ? 細胞被裂解后，細胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng) 狀、 大的復合物，在 高鹽 條件下可有效沉淀； ? 當 pH調(diào)至中性時，質(zhì)粒 DNA就可重新恢復天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng) 離心 可與染色體 DNA分離 。若一定要使用煮沸法提取該類菌株中的質(zhì)粒 DNA，可采用酚 /氯仿反復抽提，以除去該酶。 ? 細菌的裂解可采用多種方法進行，如 SDS裂解法、有機溶劑法、堿裂解法、煮沸裂解法、溶菌酶法和超聲處理等。 第三節(jié) 質(zhì)粒 DNA的提取與純化 ? 與染色體 DNA分離（ 質(zhì)粒較小，共價閉合環(huán)狀 ） ? 與蛋白質(zhì)、 RNA分離 質(zhì)粒載體 （ plasmid vector） 存在于 染色體外 胞質(zhì)中 ， 能獨立 復制 并穩(wěn)定遺傳的小的 核酸 分子 。 Tris飽和酚 (吸取下層溶液 ) (2）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。 酚抽提法：試劑作用（一） ? 酚是很強的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制 DNA酶活性； ? 氯仿能加速有機相和水相的分離； ? 異戊醇則可減少在抽提過程中由于蛋白變性產(chǎn)生的大量氣泡。 RNA沉淀置無水乙醇中可保留更長時間。 RNA電泳鑒定濃度和純度 ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear ～ 5 kb ～ 2 kb ～ ?smear RNA電泳 核酸的保存 ? DNA的儲存 DNA溶于 TE緩沖液中在 70℃ 冰箱可保存數(shù)年。 核酸蛋白檢測儀測定： ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。比值升高與降低均提示不純。2%100bp) ③ DNA構(gòu)型 ：相同分子量的閉環(huán)（ Ⅰ 型），開環(huán)（ Ⅱ 型）和線狀（ Ⅲ 型） DNA，以不同速率通過凝膠。g/ml； 單鏈寡核苷酸 A260=33181。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法： 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可吸收紫外線，其最大吸收波長為 260nm。另外還能清除部分雜質(zhì)和某些鹽離子。 核酸提?。? 溶于水 而 不溶于有機溶劑 的性質(zhì) 保持核酸的完整性（一） ? 盡量 簡化操作步驟 ，減少對核酸的破壞； ? 合適 pH值（ pH4－ 10） 過酸或過堿 －破壞磷酸二酯鍵 ? 減少 機械剪切力 ，包括劇烈的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速通過狹長孔道，細胞突置于低滲溶液中， DNA樣品反復凍融等都可引起 DNA的降解； ? 低溫操作； 保持核酸的完整性（二） ? 抑制核酸酶活性與反應速率，減少對核酸的生物降解： 內(nèi)源或外源的各種 核酸酶 能破壞磷酸二酯鍵； ? DNA酶 的激活需要 Mg2+、 Ca2+等二價金屬離子，可使用二價金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）、 檸檬酸鹽 并在低溫條件下操作，基本可抑制 DNA酶的活性； ? RNA酶 ，分布廣泛，耐高溫、耐酸堿，不易滅活。 第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則 ? 核酸分離純化的原則 ? 核酸的釋放 ,核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 核酸的鑒定方法（濃度，純度，完整性） ? 核酸的保存 材料與方法的選擇 ? 臨床診斷與研究常見的標本 —— 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)的細胞。 ? 核酸分子在 機械力 的作用下易發(fā)生斷裂。 539。 生物大分子 是指生物體內(nèi)由分子量較低的基本結(jié)構(gòu)單位首尾相連形成的多聚化合物。 病因?qū)W診斷 基因病 分子診斷 第四代實驗室診斷技術(shù) 限制性酶譜分析 診斷指標的選擇； 診斷結(jié)果的判定； 原位雜交技術(shù)－篩選 21三體（間期） 13號染色體（綠）和 21號染色體（紅）探針與羊水間期細胞雜交，可見兩個綠色信號和三個紅色信號，說明是 21三體。 2023年諾貝爾 生理學或醫(yī)學 獎 ?美國科學家布魯斯 ois Jacob 法國 巴黎巴斯德研究所 1920年 爾沃夫 Andr233。否則，你就不可能走在別人前面！ －－ 理論學習 －－實驗操作 研究生的學習 ?理論知識－ 基礎 ?實踐能力－ 平臺 ?理論指導實踐 ?實踐拓展理論 能力的提升 創(chuàng)新思維， 分析問題， 解決問題， …… 科學研究的成功之路 ? Work（ hard） ? Network ? Judgement ? luck success 《論語 基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術(shù)學院 細胞與分子診斷學系 錢 暉 ?? 而 當你走進實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象。為政》： 學而不思則罔，思而不學則殆 Will(idea) 科學研究 ? 系統(tǒng)性 ? 連續(xù)性 ? 完整性 . . . . . . 宏觀－微觀： 個體，組織，細胞，分子，基因 分子生物學 (molecular biology) 從 分子水平 去研究生命
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1