120301醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-1-wenkub
2023-03-27 15:01:56 本頁(yè)面
【正文】 現(xiàn)象 ， 并在分子水平 上 改造 和 利用 生物的一門新興學(xué)科 。 Lwoff 法國(guó) 巴黎巴斯德研究所 1902年 1994年 莫諾 Jacques Monod 法國(guó) 巴黎巴斯德研究所 1910年 1976年 發(fā)現(xiàn)了酶和病毒的合成的遺傳調(diào)節(jié) 大腸桿菌乳糖操縱子 ★ 基因表達(dá)調(diào)控 雅各布 Fran231。 博伊特勒、法國(guó)科學(xué)家朱爾斯 分子診斷 分子生物學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用 PCR技術(shù) 分子診斷丙型肝炎 2）治療能力 正確治療方案與手段 基因工程 基因治療 腺苷脫氨酶 (ADA)缺乏的 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID) ? 病因 : ? 淋巴細(xì)胞缺乏 ADA ? 腺苷、 dATP堆積 ? 破壞免疫功能 ? 患兒很少活到成年 ? 第一例基因臨床治療的方案 (,NIH) 基因治療 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 克隆與“動(dòng)物藥廠” ? 核酸水平（ DNA, RNA) 核酸的分離純化 。 第一章 生物大分子的分離純化 ? 核酸（ DNA， RNA）和蛋白質(zhì) 是生物體中最重要的生物大分子，是分子生物學(xué)研究和分子診斷的對(duì)象。–磷 酸二酯鍵 3?末端 (游離羥基 ) 5?末端 (游離磷酸基 ) DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) ?特征： ①兩條鏈以 反向平行 的方式圍繞同一中心軸向右盤繞 ②主鏈處于螺旋的外側(cè)（核糖 +磷酸） 親水核糖平面與螺旋軸平行 堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)，與中軸垂直 ③螺距： 10bp— — 3600 ?=2nm ④ 大溝與小溝 ： 蛋白質(zhì)識(shí)別 DNA的特定遺傳信息的關(guān)鍵點(diǎn) ⑤ 堿基互補(bǔ)配對(duì) A = T,C≡G 核酸變性 ? 在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對(duì)的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開(kāi)，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。 ? 堿基有共軛雙鍵，具 紫外吸收 特性，最大吸收峰在 260nm。 ? 不同研究目的對(duì)核酸的 完整性 、 純度 、 產(chǎn)量 及 濃度 有不同要求，另外尚需考慮制備核酸所需的 時(shí)間 與 成本 。 技術(shù)路線的設(shè)計(jì) 核酸的釋放 DNA和 RNA一般均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），分離純化的第一步是裂解細(xì)胞、釋放核酸 。 ? 原理 ：核酸在水溶液中以多聚陰陽(yáng)離子的化合物形式存在，它與 K+、 Na+、 Mg2+、 Li+及 NH4+等陽(yáng)離子形成的鹽，通過(guò)屏蔽帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)使 DNA、 RNA分子聚集在一起而不溶于許多有機(jī)溶劑。這一物理特性為溶液中核酸濃度的測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。g/ml； 1. 濃度測(cè)定 熒光光度法 ： 核酸的熒光染料如溴化乙錠（ ethidium bromide－ EB）， Sybr green I等嵌入堿基平面后，本身無(wú)熒光的核酸在 UV激發(fā)下發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。遷移率 Ⅰ 型 Ⅲ 型Ⅱ 型。 ? 熒光光度法： 用 EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定純度。 ? 基因組 DNA片段的分子量很大，在電場(chǎng)中泳動(dòng)很慢，如發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀； 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 RNA分布 ? rRNA的數(shù)量最多，占 80％～ 85％（主要分為 28S、18S、 5S四種）； ? 低分子量 RNA如 tRNA、 snRNA等占 15％～ 20％； ? mRNA僅占 1％～ 5％ 。當(dāng) TE的 pH為 ， DNA的脫氨反應(yīng)減少， pH低于 DNA易變性。 ? 由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的剪切力對(duì)核酸樣品有斷裂作用，在實(shí)際儲(chǔ)存時(shí)，最好將核酸制品 小量分裝 保存。 ? Tris可使 DNA順利進(jìn)入水相，避免滯留于蛋白層。 酚使用注意事項(xiàng) 基因組 DNA片段的純化 純化的原則與要求 ? 原則：一是 提高 片段的 回收率 ； 二要 清除 回收的 DNA樣品中的 雜質(zhì) 。 細(xì)菌培養(yǎng) ? 細(xì)菌培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 （ OD600） 時(shí)提取質(zhì)粒 DNA。 取決于 ３ 個(gè)因素 ? 質(zhì)粒的大小 ? 菌株種類 ? 裂解后純化質(zhì)粒 DNA的技術(shù) 細(xì)菌裂解方法的選擇 ? 大于 15kb的質(zhì)粒易受損，應(yīng)采用溫和裂解法，如SDS裂解法，將細(xì)菌懸浮于 10％蔗糖溶液中可減輕裂解時(shí)對(duì) DNA造成的機(jī)械剪切力。 細(xì)菌裂解方法的選擇 強(qiáng)堿破壞堿基配對(duì)，使宿主的線狀染色體 DNA解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒 DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。 ? 使用預(yù)冷 無(wú)水乙醇 沉淀上清液中的質(zhì)粒 DNA，再用 70%的乙醇洗滌。 ? 沉淀和洗滌后的痕量乙醇必須去除干凈，否則影響隨后的DNA溶解以及酶學(xué)反應(yīng)。 ? 條件劇烈， 只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取 。 一 . 堿裂解法 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ,最廣泛使用 ,適用于所有菌株。有些菌株不適用。 ? 制備的質(zhì)粒也有三種不同 構(gòu)型 ， 即：共價(jià)閉合環(huán)狀、線性和半開(kāi)環(huán)。 ? 缺點(diǎn)：昂貴且費(fèi)時(shí) 聚乙二醇沉淀法 ? 利用質(zhì)粒相對(duì)較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分級(jí)沉淀的純化方法。 ? 用 分子篩層析 或 RNase消化等方法去除污染。 小分子 RNA與 DNA片段的去除 ? 小分子 RNA與 DNA片段的污染，能夠提供相當(dāng)多的 5’與 3’末端。 ? 適于純化：①容易帶上切口的特大質(zhì)粒；②用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的閉環(huán)質(zhì)粒；③用于生物物理學(xué)測(cè)定的質(zhì)粒。 ? 有些實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒的純度要求更高，如哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)，對(duì)質(zhì)粒 DNA的閉合環(huán)狀構(gòu)型要求較高，因此需要對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的純化 。缺點(diǎn)是產(chǎn)率不高。 ? 條件溫和， 該法特別適用于大質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取 。 ? 質(zhì)粒 DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。 RNA， 堿裂解法 ? 操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成本低廉。 堿裂解法 : 利用質(zhì)粒 DNA和染色體 DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的 ? 在 NaOH（ － ）下，用 EDTA 和 SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，
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