120301醫(yī)學分子生物學-1(編輯修改稿)
2025-03-26 15:01 本頁面
【文章內容簡介】 性。 ? DNA是線狀高分子，粘度很大， 堿性 條件下 穩(wěn)定 ； RNA分子較小，粘度也小，對 酸穩(wěn)定 。 ? 核酸分子在 機械力 的作用下易發(fā)生斷裂。 ? 堿基有共軛雙鍵，具 紫外吸收 特性，最大吸收峰在 260nm。可對核酸進行檢測和定量，也可分析純度。 ? 核酸變性 —— 加熱、極端的 pH、有機溶劑如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。 第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則 ? 核酸分離純化的原則 ? 核酸的釋放 ,核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 核酸的鑒定方法（濃度，純度，完整性） ? 核酸的保存 材料與方法的選擇 ? 臨床診斷與研究常見的標本 —— 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)的細胞。 ? 不同研究目的對核酸的 完整性 、 純度 、 產量 及 濃度 有不同要求，另外尚需考慮制備核酸所需的 時間 與 成本 。 ? 不影響核酸制品質量與產量的前提下，應選安全的試劑與制備方案。 核酸分離純化的原則 ： 一 保持核酸一級結構的 完整性 ,因完整的一級結構是 核酸結構和功能研究的最基本的要求； 二 是盡量排除其他分子的污染，保證核酸樣品 純度 。 核酸提取－－ 溶于水 而 不溶于有機溶劑 的性質 保持核酸的完整性（一） ? 盡量 簡化操作步驟 ，減少對核酸的破壞； ? 合適 pH值（ pH4－ 10） 過酸或過堿 －破壞磷酸二酯鍵 ? 減少 機械剪切力 ，包括劇烈的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速通過狹長孔道，細胞突置于低滲溶液中， DNA樣品反復凍融等都可引起 DNA的降解； ? 低溫操作； 保持核酸的完整性（二） ? 抑制核酸酶活性與反應速率，減少對核酸的生物降解： 內源或外源的各種 核酸酶 能破壞磷酸二酯鍵； ? DNA酶 的激活需要 Mg2+、 Ca2+等二價金屬離子，可使用二價金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）、 檸檬酸鹽 并在低溫條件下操作，基本可抑制 DNA酶的活性； ? RNA酶 ，分布廣泛，耐高溫、耐酸堿，不易滅活。 技術路線的設計 核酸的釋放 DNA和 RNA一般均位于細胞內（病毒除外），分離純化的第一步是裂解細胞、釋放核酸 。 ?破碎細胞的方法 ： 包括機械和非機械法（干燥法，溶胞法）兩大類。 非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白質、多糖及脂類物質； 非需要的核酸分子 －－分離某一特定的核酸分子時，其它的核酸分子皆為雜質； 影響后繼研究的溶液和試劑 －－加入的有機溶劑和某些金屬離子； 應清除的雜質 核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 沉淀 是濃縮核酸的最常用且高效的方法，其優(yōu)點在于沉淀后易于調整核酸溶液濃度。另外還能清除部分雜質和某些鹽離子。 ? 原理 ：核酸在水溶液中以多聚陰陽離子的化合物形式存在，它與 K+、 Na+、 Mg2+、 Li+及 NH4+等陽離子形成的鹽，通過屏蔽帶負電的磷酸基團使 DNA、 RNA分子聚集在一起而不溶于許多有機溶劑。 核酸的沉淀與洗滌 ? 常用的鹽類 有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂； ? 常用的 有機溶劑 為乙醇、異丙醇和聚乙二醇。 ? 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用 70%～ 75%的乙醇 洗滌 去除。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法： 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可吸收紫外線，其最大吸收波長為 260nm。這一物理特性為溶液中核酸濃度的測定奠定了基礎。 雙鏈 DNA A260=50181。g/ml；單鏈 DNA或 RNA A260=40181。g/ml； 單鏈寡核苷酸 A260=33181。g/ml； 1. 濃度測定 熒光光度法 ： 核酸的熒光染料如溴化乙錠（ ethidium bromide－ EB）， Sybr green I等嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在 UV激發(fā)下發(fā)出熒光，且熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。 瓊脂糖凝膠電泳 －－－分離、鑒定和提純核酸片段 ? 凝膠中核酸的遷移率： ① 核酸分子的大小 ：線性雙鏈 DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。 ② 瓊脂糖濃度 ：利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛，大小不同的核酸片段（ ％ 60Kb。2%100bp) ③ DNA構型 ：相同分子量的閉環(huán)（ Ⅰ 型），開環(huán)（ Ⅱ 型）和線狀（ Ⅲ 型） DNA，以不同速率通過凝膠。遷移率 Ⅰ 型 Ⅲ 型Ⅱ 型。 質粒 DNA三種構型 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度（％， W/V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 瓊脂糖電泳鑒定 DNA濃度和 純度 ⒉ 純度鑒定 ? 紫外分光光度法： 主要通過 A260與 A280的比值來判定有無污染。在緩沖液中，純 DNA的 A260/A280為 ，純 RNA的比值為 。比值升高與降低均提示不純。 ? 熒光光度法： 用 EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可判定純度。 DNA分子較 RNA大得多，電泳遷移率低。 ? 純凈 DNA OD260 / OD280 應 =；純凈 RNA OD260 / OD280應 =； ? OD230主要吸收為多肽，苯酚等，純凈的核酸樣品OD260 / OD230 應 =； ? OD320檢測溶液的懸濁度和其它干擾因子，樣品純凈， OD320應接近零， =。 核酸蛋白檢測儀測定： ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）：
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