福建農林大學分子生物學(編輯修改稿)
2025-02-14 02:14 本頁面
【文章內容簡介】 ℃ 的熱脈沖 (heat shock)可增加 DNA 的吸收。 大腸桿菌攝取 DNA 是非選擇性的，而且可以 用異源啟動子 啟動轉錄和蛋白質合成，這使得大腸桿菌成為克隆實驗的理想系統(tǒng)。 CaCl2方法的轉化效率一般可達 106107轉化子 /μg DNA 。 關鍵是 (1)使用對數(shù)生長期的細菌； (2)低溫操作。 優(yōu)點 : 簡單、穩(wěn)定、可重復性高。 缺點 : 轉化效率稍低，而且不能轉化大質粒 (＞ 15Kb) 影響細菌轉化頻率 : 轉化 DNA的濃度、純度和構型 轉化細胞的生理狀態(tài) 經 CaCl2處理后的成活率 轉化環(huán)境：溫度、 pH、離子濃度MgCl2轉化： Mg++對于維持 DNA穩(wěn)定性方面，可能起到重要的作用。 克隆子的篩選 ?利用抗菌素抗性基因等標記 抗性基因、 Xgal和 IPTG藍白斑 ?雙酶切片段重組法 ?報告基因（ GUS、 LUC、 NPTII 、 CAT） 克隆子的鑒定 ? 酶切 ? 分子 雜交：斑點、 Southern雜交 ? PCR ? DNA測序 ? 轉錄產物檢測 ? 翻譯產物檢測 PEG( polyethyleme glycol 6000) 適用： 不能形成感受態(tài)的 G +細菌 用細胞壁降解酶完全除去肽葡聚糖層，使其維持在等滲培養(yǎng)基中，在 PEG存在條件下，質?；蚴删wDNA可高效地被導入原生質體。 植物細胞轉化 ? Ti轉化法 葉盤轉化法、原生質體共培養(yǎng)法、懸浮細胞共培養(yǎng)法 ? 直接轉移法 電穿孔、微彈轟擊法、激光微束穿孔法、多聚物介導法、花粉管通道法、顯微注射法、脂質體介導法。 建立對植物有效轉化基本要求： (1)轉化系統(tǒng)不受基因型的限制； (2)易于獲得大量的轉基因植株； (3)盡可能縮短獲得轉基因植株的周期； (4)避免使用原生質體作為轉基因受體。 基因槍轉化方法基本滿足了上述要求。 biolistic transformatio
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