120301醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-1-文庫(kù)吧資料
2025-03-12 15:01本頁(yè)面
【正文】 沉淀的鹽，需用 70%～ 75%的乙醇 洗滌 去除。 ? 原理 ：核酸在水溶液中以多聚陰陽(yáng)離子的化合物形式存在，它與 K+、 Na+、 Mg2+、 Li+及 NH4+等陽(yáng)離子形成的鹽，通過屏蔽帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)使 DNA、 RNA分子聚集在一起而不溶于許多有機(jī)溶劑。 非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)； 非需要的核酸分子 －－分離某一特定的核酸分子時(shí)，其它的核酸分子皆為雜質(zhì)； 影響后繼研究的溶液和試劑 －－加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子； 應(yīng)清除的雜質(zhì) 核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 沉淀 是濃縮核酸的最常用且高效的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于沉淀后易于調(diào)整核酸溶液濃度。 技術(shù)路線的設(shè)計(jì) 核酸的釋放 DNA和 RNA一般均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），分離純化的第一步是裂解細(xì)胞、釋放核酸 。 核酸分離純化的原則 ： 一 保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的 完整性 ,因完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是 核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的最基本的要求； 二 是盡量排除其他分子的污染，保證核酸樣品 純度 。 ? 不同研究目的對(duì)核酸的 完整性 、 純度 、 產(chǎn)量 及 濃度 有不同要求，另外尚需考慮制備核酸所需的 時(shí)間 與 成本 。 ? 核酸變性 —— 加熱、極端的 pH、有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。 ? 堿基有共軛雙鍵，具 紫外吸收 特性，最大吸收峰在 260nm。 ? DNA是線狀高分子，粘度很大， 堿性 條件下 穩(wěn)定 ； RNA分子較小，粘度也小，對(duì) 酸穩(wěn)定 。–磷 酸二酯鍵 3?末端 (游離羥基 ) 5?末端 (游離磷酸基 ) DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) ?特征： ①兩條鏈以 反向平行 的方式圍繞同一中心軸向右盤繞 ②主鏈處于螺旋的外側(cè)（核糖 +磷酸） 親水核糖平面與螺旋軸平行 堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)，與中軸垂直 ③螺距： 10bp— — 3600 ?=2nm ④ 大溝與小溝 ： 蛋白質(zhì)識(shí)別 DNA的特定遺傳信息的關(guān)鍵點(diǎn) ⑤ 堿基互補(bǔ)配對(duì) A = T,C≡G 核酸變性 ? 在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對(duì)的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。 核酸的化學(xué)組成 核 酸 （ RNA、 DNA） 核苷 酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基 核糖（ RNA） 脫氧核糖（ DNA） A、 G、 C、 U A、 G、 C、 T 堿 基 腺嘌呤 鳥嘌呤 NNN HN123456789 嘌 呤 嘧 啶 尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶 NN H132456堿 基 胞嘧啶核苷 尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNO HH ONNN H2H ONNO HH2NNNNNNNN H2OHHO HHO HHH O C H2H O C H2OHHO HHO HHOHHO HHO HHH O C H2OHHO HHO HHH O C H2如果是存在于 DNA中的脫氧核苷則 2’位則是 H而不是 OH 核 苷 磷酸 + 戊糖 + 堿基 = 核苷酸 POOO HOHOCH2O HO HNNN H2OOHOCH2O HO HNNN H2OOPOONNNNN H 2OHHO HHO HHO C H 2OPOOOPOO三磷酸腺苷 ( A TP )NTP， NDP， NMP dNTP， dNDP， dNMP 磷酸二酯鍵 DNA和 RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) RNA序列 5’ pAAUUCGAUCGAAGGCGCCGGUU3’ DNA序列 5’ pAATTCGATCGAAGGCGCCGGTT3’ 3’ TTAAGCTAGCTTCCGCGGCCAAp5’ 核苷酸鏈（一級(jí)結(jié)構(gòu)） 339。 第一章 生物大分子的分離純化 ? 核酸（ DNA， RNA）和蛋白質(zhì) 是生物體中最重要的生物大分子，是分子生物學(xué)研究和分子診斷的對(duì)象。 蛋白芯片等 ； ? 蛋白質(zhì)與核酸相互作用 凝膠滯后實(shí)驗(yàn)；染色體免疫沉淀； DNAaseI足紋分析；Southwestern雜交； ? 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 酵母雙雜交；蛋白質(zhì)免疫共沉淀； 分子生物學(xué)常用技術(shù) The Nobel Prize in Physiology or Medicine： ? 1978年 Arber等 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) ? 2023年 Fire， Mello RNA干擾 ? 2023年 Smith等 基因打靶 The Nobel Prize in Chemistry ： ? 1958年 Sanger 胰島素序列測(cè)定 ? 1980年 Sanger等 雙脫氧鏈終止法測(cè)序 ? 1993年 Mullis 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） M. Smith 寡聚核苷酸定點(diǎn)誘變技術(shù) 課程主要內(nèi)容 ? 第一章 生物大分子的分離純化 ? 第二章 分子生物學(xué)常用技術(shù)（ PCR、核酸 分子雜交、基因測(cè)序、生物芯片等） ? 第三章 基因工程 ? 第四章 基因敲除與 RNA干擾 ? 第五章 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) ? 核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及相互作用是分子水平生命活動(dòng)的 基礎(chǔ) ； ? 內(nèi)源基因的突變、
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