【正文】 質(zhì)粒 DNA的純化 ?去除蛋白質(zhì)、染色體 DNA和 RNA； ?分離質(zhì)粒的不同構(gòu)型； 質(zhì)粒 DNA純化目的 利用質(zhì)粒 DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀兩個性質(zhì) 質(zhì)粒 DNA的純化方法 ? 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心； ? 離子交換層析、凝膠過濾層析； ? 聚乙二醇沉淀法； 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心 ? 利用溴化乙錠同線性和閉合環(huán)狀 DNA分子的結(jié)合量 不同，導(dǎo)致不同構(gòu)型 DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫梯度中的 浮力密度 有所差異，從而達到分離純化的目的。 煮沸裂解法 ? 將細菌懸浮于含 TritonX100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX100和溶菌酶能破壞細胞膜，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與 DNA變性。 ? 減少細菌量，降低后續(xù)操作中裂解物的復(fù)雜性和粘稠度。在 DNA制品中加入少量氯仿，可以有效避免細菌與霉菌對核酸的污染。 瓊脂糖凝膠電泳 －－－分離、鑒定和提純核酸片段 ? 凝膠中核酸的遷移率： ① 核酸分子的大小 ：線性雙鏈 DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。 ? 不影響核酸制品質(zhì)量與產(chǎn)量的前提下，應(yīng)選安全的試劑與制備方案。 PCR技術(shù) ；分子雜交 ；分子克隆 ； RNA干擾；基因芯片； DNA測序等 ； ? 蛋白水平 蛋白分離純化； Western Blot。否則，你對事物的觀察就會受影響。 斯坦曼 免疫學領(lǐng)域：受體 /樹突狀細胞 分子生物學與醫(yī)學 ? 治病救人 1） 判斷能力 正確的診斷； 疾病治療的基礎(chǔ) 兩方面技能：診斷 +治療 2）治療能力 正確治療方案與手段 分子診斷 （ molecular diagnosis） 采用分子生物學方法，從 DNA水平 或 RNA水平檢測分析基因的存在和變異，并進一步從轉(zhuǎn)錄（ mRNA）或翻譯水平（ 蛋白質(zhì) ）分析基因的表達與功能，從而對人體狀態(tài)與疾病作出診斷。 ? 核酸變性 —— 加熱、極端的 pH、有機溶劑如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。g/ml；單鏈 DNA或 RNA A260=40181。 ? 完整的或降解很少的總 RNA電泳圖譜 中，三條帶的熒光強度積分應(yīng)呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。 ? 常用的純化方法包括有機溶劑抽提法與商品化的柱層析法（ column chromatography）－ 離子交換層析 。 RNA， 堿裂解法 ? 操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉。 ? 有些實驗對質(zhì)粒的純度要求更高，如哺乳動物轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因動物等實驗，對質(zhì)粒 DNA的閉合環(huán)狀構(gòu)型要求較高，因此需要對提取的質(zhì)粒進行進一步的純化 。 ? 缺點：昂貴且費時 聚乙二醇沉淀法 ? 利用質(zhì)粒相對較小和共價閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點進行分級沉淀的純化方法。 ? 條件劇烈， 只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的提取 。 取決于 ３ 個因素 ? 質(zhì)粒的大小 ? 菌株種類 ? 裂解后純化質(zhì)粒 DNA的技術(shù) 細菌裂解方法的選擇 ? 大于 15kb的質(zhì)粒易受損，應(yīng)采用溫和裂解法，如SDS裂解法，將細菌懸浮于 10％蔗糖溶液中可減輕裂解時對 DNA造成的機械剪切力。 ? 由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的剪切力對核酸樣品有斷裂作用，在實際儲存時，最好將核酸制品 小量分裝 保存。遷移率 Ⅰ 型 Ⅲ 型Ⅱ 型。 技術(shù)路線的設(shè)計 核酸的釋放 DNA和 RNA一般均位于細胞內(nèi)（病毒除外），分離純化的第一步是裂解細胞、釋放核酸 。 第一章 生物大分子的分離純化 ? 核酸（ DNA， RNA）和蛋白質(zhì) 是生物體中最重要的生物大分子，是分子生物學研究和分子診斷的對象。為政》： 學而不思則罔，思而不學則殆 Will(idea) 科學研究 ? 系統(tǒng)性 ? 連續(xù)性 ? 完整性 . . . . . . 宏觀－微觀： 個體，組織，細胞，分子，基因 分子生物學 (molecular biology) 從 分子水平 去研究生命現(xiàn)象 ， 并在分子水平 上 改造 和 利用 生物的一門新興學科 。 2023年諾貝爾 生理學或醫(yī)學 獎 ?美國科學家布魯斯 ? 核酸分子在 機械力 的作用下易發(fā)生斷裂。 核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法 /熒光光度法 紫外分光光度法： 基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可吸收紫外線，其最大吸收波長為 260nm。 核酸蛋白檢測儀測定： ⒊完整性鑒定 ? 瓊脂糖凝膠電泳（ agarose gel electrophoresis）： 可判定核酸制品的完整性。 Tris飽和酚 (吸取下層溶液 ) (2）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。 ? 細胞被裂解后，細胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng) 狀、 大的復(fù)合物，在 高鹽 條件下可有效沉淀； ? 當 pH調(diào)至中性時，質(zhì)粒 DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng) 離心 可與染色體 DNA分離 。 條件劇烈，只適于小質(zhì)粒 DNA（ 15kb）的制備。 ? 利用 DNA末端的酶促反應(yīng)（如末端轉(zhuǎn)移酶、 T4DNA連接酶）和測序反應(yīng)等實驗很關(guān)鍵。但有一部分質(zhì)粒 DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。若一定要使用煮沸法提取該類菌株中的質(zhì)粒 DNA，可采用酚 /氯仿反復(fù)抽提，以除去該酶。 酚抽提法：試劑作用（一） ? 酚是很強的蛋白質(zhì)變性劑，也可抑制 DNA酶活性； ? 氯仿能加速有機相和水相的分離； ? 異戊醇則可減少在抽提過程中由于蛋白變性產(chǎn)生的大量氣泡。比值升高與降低均提示不純。另外還能清除部分雜質(zhì)和某些鹽離子。 539。ois Jacob 法國 巴黎巴斯德研究所 1920年 爾沃夫 Andr233。 Lwoff 法國 巴