120301 醫(yī)學分子生物學-1(文件)
【正文】 并使細胞的蛋白質與 DNA發(fā)生變性，釋放出質粒 DNA。 ? HB101等菌株能表達核酸內切酶 A，且煮沸不能完全滅活，在 Mg2+條件下可以降解質粒 DNA， 不建議使用煮沸法 。 細菌中提純質粒 DNA的方法 ? 3個步驟： 細菌培養(yǎng)物的生長 細菌的收獲 （離心）和 裂解 質粒 DNA的純化 細菌裂解 ? 可采用離心的方法來收集細菌，由于細菌生長中產生了大量的代謝產物，為提高質粒 DNA的純度，細菌沉淀最好用STE或生理鹽水漂洗 1～ 2次。 ? 常用的純化方法包括有機溶劑抽提法與商品化的柱層析法（ column chromatography）－ 離子交換層析 。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。 去除蛋白質、 RNA ? EDTA為二價金屬離子螯合劑，可抑制 DNA酶的活性，同時還能降低細胞膜的穩(wěn)定性； ? SDS為陰離子去污劑，能引起細胞膜降解，乳化脂質和蛋白質并沉淀，同時還有降解 DNA酶的作用； ? 無 DNA酶的 RNA酶 ，可有效水解 RNA； ? 蛋白酶 K起水解蛋白質的作用，可消化 DNA酶、 DNA上的蛋白質，同時也有裂解細胞的作用。 ? RNA的儲存 RNA溶于用焦碳酸二乙酯（ diethyl pyrocarbonate， DEPC）處理過的水或三蒸水中，在 70℃ 保存，一般保存時間為一年。 ? 完整的或降解很少的總 RNA電泳圖譜 中，三條帶的熒光強度積分應呈特定的比值，沉降系數大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。 ? 純凈 DNA OD260 / OD280 應 =；純凈 RNA OD260 / OD280應 =； ? OD230主要吸收為多肽，苯酚等，純凈的核酸樣品OD260 / OD230 應 =； ? OD320檢測溶液的懸濁度和其它干擾因子，樣品純凈， OD320應接近零， =。在緩沖液中，純 DNA的 A260/A280為 ，純 RNA的比值為 。 ② 瓊脂糖濃度 ：利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛，大小不同的核酸片段（ ％ 60Kb。g/ml；單鏈 DNA或 RNA A260=40181。 ? 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用 70%～ 75%的乙醇 洗滌 去除。 非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白質、多糖及脂類物質； 非需要的核酸分子 －－分離某一特定的核酸分子時，其它的核酸分子皆為雜質； 影響后繼研究的溶液和試劑 －－加入的有機溶劑和某些金屬離子； 應清除的雜質 核酸的濃縮、沉淀與洗滌 ? 沉淀 是濃縮核酸的最常用且高效的方法，其優(yōu)點在于沉淀后易于調整核酸溶液濃度。 核酸分離純化的原則 ： 一 保持核酸一級結構的 完整性 ,因完整的一級結構是 核酸結構和功能研究的最基本的要求； 二 是盡量排除其他分子的污染，保證核酸樣品 純度 。 ? 核酸變性 —— 加熱、極端的 pH、有機溶劑如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。 ? DNA是線狀高分子，粘度很大， 堿性 條件下 穩(wěn)定 ； RNA分子較小，粘度也小，對 酸穩(wěn)定 。 核酸的化學組成 核 酸 （ RNA、 DNA） 核苷 酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基 核糖（ RNA） 脫氧核糖（ DNA） A、 G、 C、 U A、 G、 C、 T 堿 基 腺嘌呤 鳥嘌呤 NNN HN123456789 嘌 呤 嘧 啶 尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶 NN H132456堿 基 胞嘧啶核苷 尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNO HH ONNN H2H ONNO HH2NNNNNNNN H2OHHO HHO HHH O C H2H O C H2OHHO HHO HHOHHO HHO HHH O C H2OHHO HHO HHH O C H2如果是存在于 DNA中的脫氧核苷則 2’位則是 H而不是 OH 核 苷 磷酸 + 戊糖 + 堿基 = 核苷酸 POOO HOHOCH2O HO HNNN H2OOHOCH2O HO HNNN H2OOPOONNNNN H 2OHHO HHO HHO C H 2OPOOOPOO三磷酸腺苷 ( A TP )NTP， NDP， NMP dNTP， dNDP， dNMP 磷酸二酯鍵 DNA和 RNA的一級結構 RNA序列 5’ pAAUUCGAUCGAAGGCGCCGGUU3’ DNA序列 5’ pAATTCGATCGAAGGCGCCGGTT3’ 3’ TTAAGCTAGCTTCCGCGGCCAAp5’ 核苷酸鏈（一級結構） 339。 蛋白芯片等 ； ? 蛋白質與核酸相互作用 凝膠滯后實驗；染色體免疫沉淀； DNAaseI足紋分析；Southwestern雜交； ? 蛋白質與蛋白質相互作用 酵母雙雜交；蛋白質免疫共沉淀； 分子生物學常用技術 The Nobel Prize in Physiology or Medici
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