福建農(nóng)林大學(xué)分子生物學(xué)-資料下載頁(yè)
2025-01-18 02:14本頁(yè)面
【正文】 劑 (氯化鈣與亞精胺 )的濃度 等。 生理因素： 轟擊前后的培養(yǎng)條件 不同生理狀態(tài)的植物材料接受外源 DNA 的能力是不同的 動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化 ? 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 ? 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 ? DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 ? DMSO（二甲基亞砜）轉(zhuǎn)染法 ? 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 ? 顯微注射 ? 基因打靶 ? 電穿孔 transformation for mamalial animals a. 磷酸鈣沉淀法 :Ca2+促進(jìn) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收 外源 DNA ： 將過(guò)量的媒介 DNA與帶有 tk基因的 重組 DNA 混合，用 Ca2+沉淀轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 c. 微量注射： 一臺(tái)儀器每小時(shí)注射 5001000個(gè)細(xì)胞，約 50%的細(xì)胞能穩(wěn)定地整合并表達(dá)，任何 DNA都可注射到任何細(xì)胞中，效率高，不需篩選壓力，但需要昂貴的儀器，技術(shù)復(fù)雜，難以掌握。 electroporation 許多細(xì)菌和真核系統(tǒng)，無(wú)感受態(tài) 操作方便、基因轉(zhuǎn)移效率高，適用真核生物和原核生物 方法： 用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或擊成小孔，使各種大分子 (包括 DNA)通過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。 大腸桿菌中，優(yōu)化參數(shù)（電場(chǎng)強(qiáng)度、 電脈沖長(zhǎng)度、 DNA的濃度），每微克 DNA可得到1091010轉(zhuǎn)化體 主要影響因素 : 脈沖最大電壓： 電壓太小，轉(zhuǎn)化效率低； 電壓太大，細(xì)胞不能成活。 脈沖持續(xù)時(shí)間 線性化 DNA有較高的重組機(jī)率； 一般電擊前后將細(xì)胞置冰浴 10min 調(diào)節(jié)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖長(zhǎng)度使 5075％細(xì)菌死亡，可得到最高轉(zhuǎn)化效率。 最高轉(zhuǎn)化率可達(dá) 1091010轉(zhuǎn)化子 /μg DNA 。 轉(zhuǎn)化率 每毫克轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA所產(chǎn)生的具抗生素抗性的克隆數(shù) 轉(zhuǎn)化子的增殖與保存 單克隆，接種含選擇標(biāo)記抗生素的液體培養(yǎng)基中，部分菌液凍存于甘油保存液中。 克隆技術(shù)的應(yīng)用 ?重組蛋白 ?GMO ?DNA指紋分析 ?醫(yī)學(xué)診斷 ?基因治療
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