分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-資料下載頁(yè)
2025-04-04 23:13本頁(yè)面
【正文】 膠置于電泳槽，加入1TAE電泳緩沖液覆蓋膠面即可。各取PCR產(chǎn)物和DNA分子量參照物10 181。l DNA加入1181。l 6loading buffer，混合后上樣，分別加入瓊脂糖凝膠孔內(nèi)。加樣時(shí)切勿破壞點(diǎn)樣孔周圍的凝膠。3. 電泳：合上電泳槽蓋，打開電泳儀，控制電壓保持在6080V，電流在40mA 以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm 時(shí)，停止電泳。4. 染色：未加EB ，室溫下染色2025 分鐘。5. 觀察和拍照：電泳完成后切斷電源，取出凝膠，置于凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄?；蛟诓ㄩL(zhǎng)為254 nm的紫外燈下觀察DNA的熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。 【注意事項(xiàng)】1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：（1）DNA大?。哼w移速率與log N成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，遷移越慢。分子量相同的空間結(jié)構(gòu)越緊密的電泳越快，如超螺旋線性DNA。（2）瓊脂糖凝膠濃度：不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA ：瓊脂糖凝膠濃度可分辨的線性DNA片段大小（kb）%5－60%－12%－6%－4%－3％－3（3）DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀 線狀DNA 單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。（4）所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃。（5）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率（不提倡加在電泳液中）。（6）電泳緩沖液（TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率。無(wú)離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)；離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性。一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA ）。2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染，凡是沾污了EB 的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】1．電泳過程中，你自己或本組所采用的電壓為________伏特（v），電流為_______毫安（mA），通電時(shí)間為_______分鐘。 2．在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上描畫自己或?qū)嶒?yàn)組的電泳圖譜，標(biāo)明陽(yáng)極和陰極位置?！舅伎碱}】你的電泳結(jié)果如何？成功或失敗有哪些方面的原因？進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)應(yīng)注意哪些問題？ 8 / 8
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