【正文】 U5) mRNA 1ul6) 25mmol/L MgCl2 2ul7) 加水至終體積 20ul*可用1050pmol隨機引物代替Oligo(dT)作為引物。2. 將溶液混勻，以15 000r/min離心10秒鐘，將反應混合液置65℃變性5 min，使mRNA均變?yōu)閱捂湣?. 將100200單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶加入混合物中，混勻，將反應混合物置37℃溫育30min。4. 將溫育后產(chǎn)物cDNA取出一部分按照以DNA為模板的PCR擴增反應步驟進行預定循環(huán)數(shù)的擴增反應。五、注意事項1. PCR引物摩爾數(shù)的計算 在PCR反應中，引物的量是以pmol數(shù)表示的，而合成引物后，引物的量是以OD值表示的。因此，需經(jīng)適當換算，才能配置適當濃度的引物溶液。換算公式如下：1) OD值為1的引物約為33ug。2) 引物的分子量=堿基數(shù)3303) 引物pmol數(shù)=OD值331000 000= OD值1000 004) 堿基數(shù)330 堿基數(shù)3302. 結果假陰性：出現(xiàn)假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關以及PCR系統(tǒng)欠妥當；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加510次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。3. 結果假陽性：PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統(tǒng)中所擴增的產(chǎn)物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現(xiàn)假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。章 實驗十六 DNA探針的標記一、目的學習DNA探針標記的方法，為核酸的分子雜交提供基礎二、概述分子雜交是核酸鏈以堿基配對規(guī)則的一種結合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對特定核酸序列進行檢測，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測的進行標記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術的關鍵。放射性同位素標記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標記方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信號強，所以最常用。放射性同位素標記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（，125I半衰期為60天），但它所釋放β射線的能量太低，只能用于組織原位雜交。由于同位素標記的探針在使用過程中存在著上述缺點，近年來，人們在尋找非放射性標記物方面取得了很大進展。國 eppendorf管及Tip頭2. PCR儀3. 標記筆、鑷子、無粉手套4. EGFRPCR產(chǎn)物5. 地高辛標記試劑盒（DIGRandom Labeling Mix, Rabbit anti DIG, BiotinlatedGoat AntiRabbitIgG, SABCPOD, DAB Stocking buffer, Blocking reagent）6. washing buffer ( M Maleic acid, M NaCl。 pH (20176。 C)。 % (v/v) Tween 20)7. Maleic acid buffer ( M Maleic acid, M NaCl。 adjust with NaOH (solid) to pH )8. Detection buffer ( M TrisHCl, M NaCl, pH )9. TE buffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA pH )10. 微量加樣器等。四、操作步驟1. 滅菌去離子水稀釋1ug DNA至總體積16ul。2. DNA熱變性：DNA樣品于PCR儀中100℃變性10min，后迅速置于碎冰中3min以上。3. 加4 ul DIGRandom Labeling Mix，混勻后離心2000rpm5min（4℃）。4. PCR儀37℃反應過夜。5. 加2ul EDTA終止反應，標記結束。標記物20℃保存amp。gt。1年。五、注意事項1. 用于標記的DNA模板盡可能純化，以提高標記效率2. 模板DNAamp。gt。100bp。3. 經(jīng)DIG標記的探針不能用酚/氯仿抽提純化4. 根據(jù)說明書確定標記效率（標記探針及試劑盒陽性對照DIG標記DNA梯度稀釋，尼龍膜點樣，樣本變性，封閉，雜交，現(xiàn)色定量）5. 本法亦可用于單鏈DNA或RNA探針的標記，當標記RNA探針時，需采用逆轉(zhuǎn)錄酶，收獲產(chǎn)物為標記的單鏈cDNA。6. 可根據(jù)下表標記產(chǎn)物DNA摸板量（ng） 標記1小時產(chǎn)物（ng） 標記20小時產(chǎn)物（ng）10 45 60030 130 1050100 270 1500300 450 200010000 850 23003000 1350 2650 分子生物學與細胞生物學實驗基本技術９ 實驗十七 Southern blot一、目的學習Southern blot技術及其應用二、概述，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（NC）濾膜上，用探針進行雜交，檢測DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以32P標記放射性探針為例，放射自顯影觀察結果?；パa的核苷酸序列通過WalsonCrick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細胞總DNA 或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞 EcoRl 基因組DNA或PCR產(chǎn)物等樣品3. 去離子水4. eppendorf管及Tip頭5. PCR儀6. 標記筆、無粉手套等（二）、操作步驟：1. 設置50ul反應體系，在200ulEP管中加入：10ug基因組DNA x ul去離子水 49xul10buffer 5 ulEcoRl 4 ul2. 充分混勻，離心20S。3. 置于PCR議上37℃反應過夜4. 加1/10體積乙酸鈉、2體積無水乙醇沉淀DNA晾干5. 加20ulTE buffer溶解DNA四、DNA瓊脂糖凝膠電泳（一）、試劑及材料1. 電泳級瓊脂糖2. 10TBE （ Tris base, 硼酸, 20mM EDTA）3. 10mg/mlEB （誘變劑，4℃避光保存）4. DNA酶切樣本5. 6DNA landing buffer （% 溴酚藍，40%蔗糖水溶液）6. 水平電泳儀（二）、操作步驟1. TBE ％瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。2. 凝固后，去除樣品梳及膠帶，置于水平電泳儀中。3. 將DNA樣品用6DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20V/10mA）直至染料電泳至邊緣。4. 電泳完畢，取出凝膠切角并在凝膠成像系統(tǒng)成像記錄。 微型水平瓊脂糖電泳槽效果圖 五、DNA轉(zhuǎn)移與固定（一）、試劑及材料1. 2M HCl2. 變性液（ NaOH）3. 20SSC轉(zhuǎn)移液（3mol/L NaCl, ,用1mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH ）4. 轉(zhuǎn)移槽5. 吸水紙及濾紙、尼龍膜等（二）、操作步驟1. HCl中處理30min，去離子水洗1次。2. 堿變性： NaOH變性液中作用20min。3. 毛細管法轉(zhuǎn)移：根據(jù)凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標記4. 去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5min。5. 按下圖安裝轉(zhuǎn)移槽進行轉(zhuǎn)移過夜( NaOH轉(zhuǎn)移液)。6. 轉(zhuǎn)移完畢后取出尼龍膜，2SSC浸泡5min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。 毛細管法轉(zhuǎn)移DNA示意圖 六、預雜交與雜交（一）、試劑及材料1. DIG Easy Hyb工作液2. 雜交爐（二）、操作步驟1. 預雜交:將尼龍膜置于預熱DIG Easy Hyb工作液（37℃42℃）中搖晃充分作用30min。2. 探針變性：DIG標記探針煮沸5min后迅速置于碎冰中，用預熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。3. 棄去預雜交液，加入雜交液42℃搖動孵育4小時或過夜。4. 2SSC（in 0.％SDS）洗膜2次（5min2）.不斷搖動。5. 5SSC（in 0.％SDS）洗膜2次（155min2，6568℃），期間不斷搖動。 七、雜交檢測（一）、試劑及材料1. Washing buffer2. maleic acid buffer`3. detection buffer4. TEbuffer5. blocking buffer (見DNA探針標記實驗)6. antibody buffer7. colorsubstrate solution（二）、操作步驟1. Washing buffer潤洗1遍（35min）。2. 100ml blocking buffer工作液封閉30min。3. 100ml antibody buffer(1:5000)孵育30min。4. Washing buffer洗膜（15min2）5. 20ml detection buffer 平衡25min。6. 將尼龍膜置于10ml colorsubstrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時不要搖動）。7. 當出現(xiàn)條帶時，TEbuffer洗膜（5min1），終止現(xiàn)色。8. 照相記錄，80℃烤干，儲存。9. 掃描計算EGFR基因擴增的倍數(shù)八、注意事項1. 為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過，沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜，使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無法接觸。2. 核酸轉(zhuǎn)移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。3. 尼龍膜漂洗盡量徹底，可降低背景。4. colorsubstrate solution要新鮮配制。5. Tm = + (% G + C) (600/l) [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25176。 C(The given numbers of the equation were calculated according to a standard(The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.) The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 2025176。 C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismat