【正文】 U5) mRNA 1ul6) 25mmol/L MgCl2 2ul7) 加水至終體積 20ul*可用1050pmol隨機(jī)引物代替Oligo(dT)作為引物。2. 將溶液混勻，以15 000r/min離心10秒鐘，將反應(yīng)混合液置65℃變性5 min，使mRNA均變?yōu)閱捂湣?. 將100200單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶加入混合物中，混勻，將反應(yīng)混合物置37℃溫育30min。4. 將溫育后產(chǎn)物cDNA取出一部分按照以DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增反應(yīng)。五、注意事項(xiàng)1. PCR引物摩爾數(shù)的計(jì)算 在PCR反應(yīng)中，引物的量是以pmol數(shù)表示的，而合成引物后，引物的量是以O(shè)D值表示的。因此，需經(jīng)適當(dāng)換算，才能配置適當(dāng)濃度的引物溶液。換算公式如下：1) OD值為1的引物約為33ug。2) 引物的分子量=堿基數(shù)3303) 引物pmol數(shù)=OD值331000 000= OD值1000 004) 堿基數(shù)330 堿基數(shù)3302. 結(jié)果假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加510次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。3. 結(jié)果假陽性：PCR結(jié)果的假陽性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。章 實(shí)驗(yàn)十六 DNA探針的標(biāo)記一、目的學(xué)習(xí)DNA探針標(biāo)記的方法，為核酸的分子雜交提供基礎(chǔ)二、概述分子雜交是核酸鏈以堿基配對(duì)規(guī)則的一種結(jié)合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子雜交這一特性來對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測(cè)的進(jìn)行標(biāo)記，這條鏈就稱為核酸探針。因此，核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。放射性同位素標(biāo)記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期限制（，125I半衰期為60天），但它所釋放β射線的能量太低，只能用于組織原位雜交。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過程中存在著上述缺點(diǎn)，近年來，人們?cè)趯ふ曳欠派湫詷?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展。國 eppendorf管及Tip頭2. PCR儀3. 標(biāo)記筆、鑷子、無粉手套4. EGFRPCR產(chǎn)物5. 地高辛標(biāo)記試劑盒（DIGRandom Labeling Mix, Rabbit anti DIG, BiotinlatedGoat AntiRabbitIgG, SABCPOD, DAB Stocking buffer, Blocking reagent）6. washing buffer ( M Maleic acid, M NaCl。 pH (20176。 C)。 % (v/v) Tween 20)7. Maleic acid buffer ( M Maleic acid, M NaCl。 adjust with NaOH (solid) to pH )8. Detection buffer ( M TrisHCl, M NaCl, pH )9. TE buffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA pH )10. 微量加樣器等。四、操作步驟1. 滅菌去離子水稀釋1ug DNA至總體積16ul。2. DNA熱變性：DNA樣品于PCR儀中100℃變性10min，后迅速置于碎冰中3min以上。3. 加4 ul DIGRandom Labeling Mix，混勻后離心2000rpm5min（4℃）。4. PCR儀37℃反應(yīng)過夜。5. 加2ul EDTA終止反應(yīng)，標(biāo)記結(jié)束。標(biāo)記物20℃保存amp。gt。1年。五、注意事項(xiàng)1. 用于標(biāo)記的DNA模板盡可能純化，以提高標(biāo)記效率2. 模板DNAamp。gt。100bp。3. 經(jīng)DIG標(biāo)記的探針不能用酚/氯仿抽提純化4. 根據(jù)說明書確定標(biāo)記效率（標(biāo)記探針及試劑盒陽性對(duì)照DIG標(biāo)記DNA梯度稀釋，尼龍膜點(diǎn)樣，樣本變性，封閉，雜交，現(xiàn)色定量）5. 本法亦可用于單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記，當(dāng)標(biāo)記RNA探針時(shí)，需采用逆轉(zhuǎn)錄酶，收獲產(chǎn)物為標(biāo)記的單鏈cDNA。6. 可根據(jù)下表標(biāo)記產(chǎn)物DNA摸板量（ng） 標(biāo)記1小時(shí)產(chǎn)物（ng） 標(biāo)記20小時(shí)產(chǎn)物（ng）10 45 60030 130 1050100 270 1500300 450 200010000 850 23003000 1350 2650 分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)９ 實(shí)驗(yàn)十七 Southern blot一、目的學(xué)習(xí)Southern blot技術(shù)及其應(yīng)用二、概述，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（NC）濾膜上，用探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以32P標(biāo)記放射性探針為例，放射自顯影觀察結(jié)果?；パa(bǔ)的核苷酸序列通過WalsonCrick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細(xì)胞總DNA 或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞 EcoRl 基因組DNA或PCR產(chǎn)物等樣品3. 去離子水4. eppendorf管及Tip頭5. PCR儀6. 標(biāo)記筆、無粉手套等（二）、操作步驟：1. 設(shè)置50ul反應(yīng)體系，在200ulEP管中加入：10ug基因組DNA x ul去離子水 49xul10buffer 5 ulEcoRl 4 ul2. 充分混勻，離心20S。3. 置于PCR議上37℃反應(yīng)過夜4. 加1/10體積乙酸鈉、2體積無水乙醇沉淀DNA晾干5. 加20ulTE buffer溶解DNA四、DNA瓊脂糖凝膠電泳（一）、試劑及材料1. 電泳級(jí)瓊脂糖2. 10TBE （ Tris base, 硼酸, 20mM EDTA）3. 10mg/mlEB （誘變劑，4℃避光保存）4. DNA酶切樣本5. 6DNA landing buffer （% 溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液）6. 水平電泳儀（二）、操作步驟1. TBE ％瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。2. 凝固后，去除樣品梳及膠帶，置于水平電泳儀中。3. 將DNA樣品用6DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20V/10mA）直至染料電泳至邊緣。4. 電泳完畢，取出凝膠切角并在凝膠成像系統(tǒng)成像記錄。 微型水平瓊脂糖電泳槽效果圖 五、DNA轉(zhuǎn)移與固定（一）、試劑及材料1. 2M HCl2. 變性液（ NaOH）3. 20SSC轉(zhuǎn)移液（3mol/L NaCl, ,用1mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH ）4. 轉(zhuǎn)移槽5. 吸水紙及濾紙、尼龍膜等（二）、操作步驟1. HCl中處理30min，去離子水洗1次。2. 堿變性： NaOH變性液中作用20min。3. 毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移：根據(jù)凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標(biāo)記4. 去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5min。5. 按下圖安裝轉(zhuǎn)移槽進(jìn)行轉(zhuǎn)移過夜( NaOH轉(zhuǎn)移液)。6. 轉(zhuǎn)移完畢后取出尼龍膜，2SSC浸泡5min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。 毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移DNA示意圖 六、預(yù)雜交與雜交（一）、試劑及材料1. DIG Easy Hyb工作液2. 雜交爐（二）、操作步驟1. 預(yù)雜交:將尼龍膜置于預(yù)熱DIG Easy Hyb工作液（37℃42℃）中搖晃充分作用30min。2. 探針變性：DIG標(biāo)記探針煮沸5min后迅速置于碎冰中，用預(yù)熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。3. 棄去預(yù)雜交液，加入雜交液42℃搖動(dòng)孵育4小時(shí)或過夜。4. 2SSC（in 0.％SDS）洗膜2次（5min2）.不斷搖動(dòng)。5. 5SSC（in 0.％SDS）洗膜2次（155min2，6568℃），期間不斷搖動(dòng)。 七、雜交檢測(cè)（一）、試劑及材料1. Washing buffer2. maleic acid buffer`3. detection buffer4. TEbuffer5. blocking buffer (見DNA探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn))6. antibody buffer7. colorsubstrate solution（二）、操作步驟1. Washing buffer潤洗1遍（35min）。2. 100ml blocking buffer工作液封閉30min。3. 100ml antibody buffer(1:5000)孵育30min。4. Washing buffer洗膜（15min2）5. 20ml detection buffer 平衡25min。6. 將尼龍膜置于10ml colorsubstrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。7. 當(dāng)出現(xiàn)條帶時(shí)，TEbuffer洗膜（5min1），終止現(xiàn)色。8. 照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。9. 掃描計(jì)算EGFR基因擴(kuò)增的倍數(shù)八、注意事項(xiàng)1. 為了防止緩沖液流從凝膠邊緣之外通過，沿凝膠的每一邊放置一條 Parafilm膜，使濾紙橋與層疊上部的吸濕材料無法接觸。2. 核酸轉(zhuǎn)移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。3. 尼龍膜漂洗盡量徹底，可降低背景。4. colorsubstrate solution要新鮮配制。5. Tm = + (% G + C) (600/l) [l = length of hybrid in base pairs], Topt. = Tm –20 to 25176。 C(The given numbers of the equation were calculated according to a standard(The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.) The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 2025176。 C below the calculated Tm value. Topt. can be regarded as a stringent hybridization temperature allows up to 18% mismat