【正文】 常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為。可分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。常用的有T4（噬菌體） DNA連接酶。 磷酸基和339。5兩種酶有相同的緩沖液，可雙酶切；不同，先用需低鹽緩沖液的限制酶消化，再用需高鹽緩沖液的酶消化。3取酶時(shí)量要準(zhǔn)，最后加酶，最好在冰箱里加。其主要勝用途：改造及組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析注意事項(xiàng)1酶切底物DNA要純，抽提時(shí)酚／氯仿要去除干凈。 。5‘ …G▼AATT C…3’ 5‘ …N▼AATT N …3’ 星號活力 EcoR I * 誘發(fā)星號活力常見原因：高甘油含量（5%，V/V）內(nèi)切酶用量過大， （100U/181。同工異源酶1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶2. 特點(diǎn)：1）識別相同順序 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnI GGTAC C 　　SstI 　 CCGC GG 　 Asp718 G GTACC 　　SacI 　 CCGC GG同尾酶有些限制酶識別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端，稱這些酶為同尾酶。 …G ACGTC… 539。 …G▲ACGT C…539。 Pst I 539。如Pst I： 539。 端切割產(chǎn)生339。 …CTTAA G… 539。 …C TTAA▲G…539。 …G AATTC…339。 …G▼AATT C…339。 端切割產(chǎn)生539。 ⑵在對稱軸兩側(cè)相對位點(diǎn)分別切割一條鏈。 …CAA TTG … 539。 …CAA▲TTG…539。 Hpa I 539。44＝2546＝40948＝65536II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：⑴在對稱軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端，如Hpa I： 539。識別順序一般為4－6個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。重組DNA技術(shù)中常用的是II型限制性內(nèi)切酶。 例如，從大腸桿菌（Escherichia Coli）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱為EcoR I。通常有三個(gè)斜體字母的縮寫表示。 限制性內(nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是指能識別DNA的特殊序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類酶。一、分子克隆中常用的工具酶在重組DNA與基因工程中，對目的基因的分離、剪切和重組涉及到一系列酶催化反應(yīng)，這些酶就像外科醫(yī)生的手術(shù)刀一樣，是進(jìn)行基因工程操作必不可少的工具?；旌现亟ㄓ媒湍讣?xì)胞生產(chǎn)乙型肝炎病毒亞單位疫苗乙肝病毒包括包膜蛋白，核心蛋白，病毒DNA用基因工程方法制備乙肝表面包膜蛋白為抗原亞單位疫苗無致病力，很安全、高效。融合蛋白。第一個(gè)用細(xì)菌表達(dá)的用于人類的基因重組藥物——人胰島素上市（ 1979年美國基因技術(shù)公司）牛、豬胰島素，免疫反應(yīng)。應(yīng)用實(shí)例重組DNA技術(shù)跨越天然物種屏障，將原核和真核生物，植物和動物，細(xì)菌和人，動物和人的基因連接起來，進(jìn)行基因交流。⑤從篩選出的陽性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。③將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。哺乳動物的克隆：克隆概念在個(gè)體水平上的應(yīng)用采用了核質(zhì)分離、細(xì)胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術(shù) 主要內(nèi)容①從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。生物技術(shù)工程的興起為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展和工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步提供了巨大動力。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為基因工程。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆。所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體?；蚬こ踢@門新興學(xué)科也就由此誕生了。1972年，（一種猴病毒）的DNA和噬菌體DNA分別切割，又將兩者接在一起，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組的人工DNA分子。分子克?。ɑ蚬こ蹋┣把远兰o(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)二十世紀(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì) 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制深刻意義在于：解決了基因自我復(fù)制和遺傳信息的傳遞問題50年代末和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼。（三） 小分子RNA(lin4RNA的影響1993年發(fā)現(xiàn)一種小分子lin4RNA像霉和調(diào)節(jié)蛋白那樣對真核生物的翻譯起阻抑作用。（二） mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)真核基因，mRNA的穩(wěn)定性差別很大，為珠蛋白的，半衰期10小時(shí)以上，而有些只有30分鐘。2. 選擇剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用Bax基因編碼產(chǎn)生幾種蛋白，緣于mRNA的選擇剪接形成不同的表達(dá)產(chǎn)物。（二）mRNA選擇性剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用1. mRNA選擇剪接 1）外顯子選擇 ，也稱外顯子跳躍：一是外顯子全部保留，二是刪除一個(gè)或幾個(gè)外顯子。 特異轉(zhuǎn)錄因子：為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所需，決定該基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)。2. 增強(qiáng)子的作用是沒有方向性的3. 增強(qiáng)子既可位于啟動子的上游，也可位于啟動子的下 游，還可位于啟動子內(nèi)部4. 增強(qiáng)子無基因的特異性，對各種基因的啟動子均有作用，但有組織特異性。（一） 順式作用元件 啟動子 增強(qiáng)子 沉默子增 強(qiáng)子：由約200bp的DNA序列組成其作用在于增加轉(zhuǎn)錄的頻率。單順反子：真核生物轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈，真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（二） mRNA的穩(wěn)定性增加mRNA 的穩(wěn)定性，延長 mRNA壽命，可提高翻譯水平。由反義RNA基因轉(zhuǎn)錄而來。其后又緊跟一串U殘基，轉(zhuǎn)錄終止Trp缺乏時(shí)，沒有色氨酸t(yī)RNA供給，前導(dǎo)肽的翻譯至Trp密碼子（UGG）時(shí)停止，核蛋白體不再移動，占據(jù)1區(qū)位置，區(qū)域2，3配對，區(qū)域4空出，不形成轉(zhuǎn)錄終止信號。前導(dǎo)肽的第11位是兩個(gè)連續(xù)的Trp。前導(dǎo)序列轉(zhuǎn)錄的RNA 5’ 端162個(gè)核苷酸順序，這段mRNA包含4個(gè)彼此互補(bǔ)的區(qū)域，可形成獨(dú)特的二級結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄衰減的DNA作用部位稱為衰減子。阻遏蛋白當(dāng)沒有色氨酸結(jié)合阻遏蛋白時(shí)，阻遏蛋白不能結(jié)合O序列，基因開始轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)存在乳糖時(shí)，cAMPCAP復(fù)合物 與CAP位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，翻譯出三種酶，細(xì)菌可分解利用乳糖作為能源。當(dāng)有葡萄糖存在時(shí)， cAMP濃度較低， cAMP與CAP 結(jié)合受阻，lac操縱子表達(dá)下降（4）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)Lac阻遏蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)與cAMP正性調(diào)節(jié)兩種機(jī)制協(xié)調(diào)合作無乳糖，無誘導(dǎo)物時(shí)，轉(zhuǎn)錄作用被I表達(dá)的阻遏蛋白所阻斷有誘導(dǎo)物時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)，從操縱基因上解離出來。別乳糖作為誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離，發(fā)生轉(zhuǎn)錄沒有乳糖存在時(shí)(基因關(guān)閉)有乳糖存在時(shí)(基因開放)mRNA8半乳糖醛酶乳糖、半乳糖乳糖在透酶催化、轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，再經(jīng)b半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變成別乳糖。I序列表達(dá)的lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動。5. 阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性6. 影響轉(zhuǎn)錄的因素 1)啟動子 2)s 因子 3)阻遏蛋白 4)正調(diào)控蛋白 5)倒位蛋白 6) RNA聚合酶抑制物 7)衰減子　原核生物基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，即對RNA合成的調(diào)控，因此通常有兩種調(diào)控方式：一種是起始調(diào)控，即啟動了調(diào)控；另一種終止調(diào)控，即衰減子調(diào)控。產(chǎn)生阻遏作用的小分子物質(zhì)叫輔阻遏物。乳糖操縱子即屬此類型?？烧T導(dǎo)操縱子：加入小分子后則開啟基因的轉(zhuǎn)錄活性，這種作用及過程叫誘導(dǎo)。正、負(fù)調(diào)控系統(tǒng)是按照沒有調(diào)節(jié)蛋白存在的情況下操縱子對于新加入的調(diào)節(jié)蛋白的響應(yīng)情況來定義的。這類調(diào)節(jié)蛋白稱為阻遏蛋白或阻遏物。蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用 形成二聚體或多聚體，間接結(jié)合DNA 是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA最常見的結(jié)合形式 4. RNA聚合酶（1）啟動序列/啟動子與RNA聚合酶活性（2）調(diào)節(jié)蛋白與RNA聚合酶活性第二節(jié) 原核基因表達(dá)的調(diào)控一、原核基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(一)原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)1. 只有一種RNA 聚合酶 , s 因子決定RNA聚合酶識別特異性2. 操縱子模型的普遍性,數(shù)個(gè)可轉(zhuǎn)錄編碼基因,一關(guān)俱關(guān)。 3. DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用DNA蛋白質(zhì)相互作用主要 指反式作用因子和順式作用元件之間的特異識別。真核生物 基因調(diào)節(jié)蛋白又稱轉(zhuǎn)錄因子 絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過與特異的順式作用元件結(jié)合（ DNA蛋白質(zhì)相互作用）反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，稱為反式作用因子有些真核調(diào)節(jié)蛋白可特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關(guān)閉，稱為順式作用蛋白基因產(chǎn)物特異識別、結(jié)合其它基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)其它基因的開啟或關(guān)閉稱為反式調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關(guān)閉稱為順式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子能直接或間接與RNA聚合酶結(jié)合的反式作用因子.按功能特性可分為:基本轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必需的一組蛋白因子，決定三種RNA轉(zhuǎn)錄的類別。激活蛋白：可結(jié)合啟動序列鄰近的DNA序列，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶活性。2. 調(diào)節(jié)蛋白原核生物基因調(diào)節(jié)蛋白（DNA結(jié)合蛋白）分為三類特異因子：決定RNA聚合酶對一個(gè)或一套啟動序列的特異性識別和結(jié)合能力。又稱沉默基因、沉默元件(。其DNA序列常與啟動序列交錯、重疊。原核生物啟動子序列按功能的不同可分為三個(gè)部位，即起始部位、結(jié)合部位、識別部位。又稱啟動子。調(diào)控序列中的啟動子是RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子。原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的?！?yīng)環(huán)境條件變化基因表達(dá)水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)，這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因 隨環(huán)境條件變化而基因表達(dá)水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因。組成性基因表達(dá)也不是一成不變的，其表達(dá)強(qiáng)弱也是受一定機(jī)制調(diào)控的。二、基因表達(dá)的方式（一）組成性表達(dá) 指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達(dá)。 基因表達(dá)調(diào)控：是指對基因組中某一個(gè)基因或一些功能相近的基因表達(dá)（生物體內(nèi)基因表達(dá)）的開啟、關(guān)閉和表達(dá)強(qiáng)度的直接調(diào)節(jié)。即是指DNA攜帶的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，mRNA通過翻譯將基因的遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)合成具有生物功能的各種蛋白質(zhì)的過程。人類將依賴這張“生命元素周期表”徹底解開人類進(jìn)化和生命之謎，同時(shí)有望徹底闡明人類6000多種單基因、多基因遺傳病的發(fā)病機(jī)制，并為這些疾病的診斷、治療及預(yù)防奠定基礎(chǔ)，人類健康的歷史將翻開全新的一頁。2000年6月，美國、英國、法國、德國、日本與中國幾乎同時(shí)宣布人類基因組工作草圖完成，盡管該工作草圖還需進(jìn)一步補(bǔ)充完善，但它的完成卻是科學(xué)界一個(gè)具有里程碑意義的重大成就。測定人類基因組的核苦酸順序是人類基因組計(jì)劃中最為明確、最為艱苦的定時(shí)、定量、定質(zhì)的任務(wù)。轉(zhuǎn)錄圖具有特定的生物學(xué)意義。因此如果能把mRNA（或cDNA）先分離、定位，就抓住了基因的主要部分（可轉(zhuǎn)錄的部分）。這段已知核苷酸序列的DNA片段稱為序列標(biāo)記位點(diǎn)，在基因組中應(yīng)有明確的位置。遺傳圖所表現(xiàn)的，是通過連鎖分析確定的各基因間的相對位置。 ? 2002年? 六國科學(xué)家公布人類基因組細(xì)節(jié)研究成果 四張圖譜 1. 遺傳圖譜 遺傳圖的繪制是人類基因組研究的第一步，是以染色體上某一點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，以與之相伴遺傳的特征為對象，經(jīng)連鎖分析，將編碼該特征的基因定位于染色體特定位置。? １２月１４日 美英等國科學(xué)家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜，這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。? ５月８日 德、日等國科學(xué)家宣布，已基本完成了人體第２１對染色體的測序工作。? ２０００年? ４月６日 美國塞萊拉公司宣布破譯出一名實(shí)驗(yàn)者的完整遺傳密碼，但遭到不少科學(xué)家的質(zhì)疑。中國是繼美、英、日、德、法之后第６個(gè)國際人類基因組計(jì)劃參與國，也是參與這一計(jì)劃的唯一發(fā)展中國家。? １２月 一種小線蟲完整基因組序列的測定工作宣告完成，這是科學(xué)家第一次繪出多細(xì)胞動物的基因組圖譜。 基因組研究大事記? １９９０年? １０月 被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計(jì)劃”的國際人類基因組計(jì)劃啟動。? 1998年，最后一個(gè)五年計(jì)劃指定出來，HGP提前2年于2003年完成。? 1990年，NIH和DOE聯(lián)合提出美國人類基因組計(jì)劃，正式啟動HGP，計(jì)劃于15年內(nèi)提供30億美元的資助，在2005年完成人類基因組全部序列的測定。 ? 1986年美國宣布啟動“人類基因組啟動計(jì)劃” 。 研究背景? 1985年，美國能源部（DOE）率先提出，旨在闡明人類基因組 DNA長達(dá)3109堿基對（ base pair，bp）的序列。 串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性? 有一些重復(fù)序列，其重復(fù)單位很小，比如（CC）n、（ATT）n，但串聯(lián)重復(fù)次數(shù)有較大的變化，形成串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性，也稱為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variablc number of tandcm repeats，VNTRs），這是另一種DNA序列長度多態(tài)性，這種多態(tài)性在人群中有極高的頻率。