【正文】 4酶切反應(yīng)2小時左右，可延長，節(jié)約酶量。 …CTGCA G…3‘ 339。 端突出的粘性末端，如EcoR I： 539。限制酶的分類及特點(diǎn) 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為I、II、III型。利用大腸桿菌（)、酵母、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)人類所需要的，從其他方法又難以大量獲得的重組蛋白質(zhì)。 基本概念基因工程的核心是重組DNA技術(shù)，又叫DNA克隆。（二） 反式作用因子1. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分類（按功能特性） 基本轉(zhuǎn)錄因子： 指普遍存在于各種細(xì)胞中、結(jié)合在TATA盒附近的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近的DNA特異序列形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。它是位于結(jié)構(gòu)基因上游前導(dǎo)序列中具有終止子結(jié)構(gòu)的短序列?？勺瓒舨倏v子：加入小分子后則關(guān)閉基因的轉(zhuǎn)錄活性，這種作用及過程叫阻遏。阻遏蛋白：可結(jié)合特異DNA序列——操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄。(三) 協(xié)調(diào)表達(dá): 一定機(jī)制控制下，功能相關(guān)的一組基因,協(xié)調(diào)一致,共同表達(dá),即協(xié)調(diào)表達(dá)(三、基因表達(dá)調(diào)控的基本原理（一）基因表達(dá)的多級調(diào)控基因在五個不同層次上的調(diào)控：DNA水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄后調(diào)控翻譯調(diào)控翻譯后調(diào)控（二）基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素1. 特異DNA序列2. 調(diào)節(jié)蛋白3. DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用4. RNA聚合酶1. 特異DNA序列特異DNA序列主要指具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列。4. 序列圖譜? 人類基因組核苷酸序列圖（sequence map）也就是分子水平上最高層次、最詳盡的物理圖。? １２月１日 國際人類基因組計劃聯(lián)合研究小組宣布，完整破譯出人體第２２對染色體的遺傳密碼，這是人類首次成功地完成人體染色體完整基因序列的測定。所以，RFLP的基礎(chǔ)是高度重復(fù)序列（數(shù)量大）和點(diǎn)突變。 移動基因（轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)位子，transposon） ? 可從染色體基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的基因，也可在不同的染色體之間跳躍。它們可能是由于失去起始轉(zhuǎn)錄信號，或外顯子—內(nèi)含子連接處不能剪接或翻譯不能終止。最常見是2bp串聯(lián)（即(AC)n和(TG)n，約占10%），散在分布在基因組中，多位于編碼區(qū)附近，也存在于衛(wèi)星序列中及中度重復(fù)序列中?；虿淮嬖诓倏v子結(jié)構(gòu)，功能相關(guān)基因分散在不同的染色體上。質(zhì)粒是一個完整、獨(dú)立的復(fù)制子，并且能夠轉(zhuǎn)化細(xì)胞（把它的一個復(fù)本從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞），因此可以作為一種載體，把目的DNA帶入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖。細(xì)菌基因組 1. 一條雙鏈DNA ，具有類核結(jié)構(gòu)。 反式作用因子：是分布于不同或相同染色體上基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的活性。側(cè)約10和35個核苷酸處，弱啟動子序列中往往有多處核苷酸被置換。(4)終止轉(zhuǎn)錄。DNA分子的自發(fā)性損傷（1）DNA復(fù)制中的錯誤（2）DNA的自發(fā)性化學(xué)變化：堿基的異構(gòu)互變、堿基的脫氨基作用、脫嘌呤與脫嘧啶、堿基修飾與鏈斷裂物理因素引起的DNA損傷（1）紫外線引起的DNA損傷（2）電離輻射引起的DNA損傷化學(xué)因素引起的DNA損傷（1）烷化劑對DNA的損傷（2）堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷（二）DNA損傷的后果點(diǎn)突變：指DNA上的單一堿基的變異（轉(zhuǎn)換：嘌呤與嘌呤、嘧啶與嘧啶；顛換：嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤）缺失：指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失插入：指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中倒位或轉(zhuǎn)位：指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處雙鏈斷裂（三）DNA修復(fù)回復(fù)修復(fù)這是較簡單的修復(fù)方式，一般都能將DNA修復(fù)到原樣（1）光修復(fù)最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式，由細(xì)菌中的光解酶完成。 二、DNA復(fù)制的特點(diǎn)復(fù)制 以DNA為模板,按堿基互補(bǔ)配對原則,聚合成新的DNA鏈的過程。 ? 原核細(xì)胞rRNA包括：5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA + 蛋白質(zhì) + 蛋白質(zhì) 大亞基 小亞基? 真核細(xì)胞rRNA包括：5S rRNA rRNA 28S rRNA 18S rRNA + 蛋白質(zhì) + 蛋白質(zhì) 大亞基 小亞基rRNA二級結(jié)構(gòu)：有較多莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是酶性RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 基因（gene)是一個功能性遺傳單位，是合成一個有功能蛋白或RNA所必需的全部DNA序列。 兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈繞同一中心軸，右手螺旋。三、生物工程與生物制藥基因工程生產(chǎn)多肽類藥物：人胰島素、人生長激素、干擾素、紅細(xì)胞生成素、孕激素、白介素11集落刺激因子、免疫球蛋白、B細(xì)胞生長因子。六．基因與疾病。*分子生物學(xué)：從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動規(guī)律的一門新興邊緣學(xué)科。四。人體的生長、發(fā)育、衰老、死亡等生命現(xiàn)象，人體各種疾病的發(fā)生，都是一種或多基因有關(guān)，常常涉及到細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 RNA DNAAMP、ADP、ATP dAMP、dADP、dATPGMP、GDP、GTP dGMP、dGDP、dGTPCMP、CDP、CTP dCMP、dCDP、dCTPUMP、UDP、UTP dTMP、dTDP、dTTP二磷酸核苷和三磷酸核苷多為核苷酸有關(guān)代謝中間產(chǎn)物或酶活性及代謝的調(diào)節(jié)物質(zhì)。216。 3’末端的polyA結(jié)構(gòu): 參與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性252。如核酸是由核苷酸與核苷酸相連而構(gòu)成的，蛋白質(zhì)的多肽鏈?zhǔn)怯砂被崤c氨基酸相連而成。走向的DNA聚合酶不可能合成連續(xù)新鏈，只能以不連續(xù)的方式分段進(jìn)行。原核生物的RNA聚合酶可以直接辨認(rèn)啟動子，真核生物的RNA聚合酶則需藉助於轉(zhuǎn)錄因子。別的還有調(diào)控方式，參與的因子等不同五、轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄單位：指RNA聚合酶作用的起始點(diǎn)與終止位點(diǎn)之間的DNA順序轉(zhuǎn)錄子：指2個或2個以上緊密連鎖并共同轉(zhuǎn)錄一種mRNA分子的結(jié)構(gòu)基因組成的復(fù)合單位。而終止密碼子是作為翻譯終止的信號，在下圖中，DNA分子下面一條被從左到右轉(zhuǎn)錄，從畫線DNA轉(zhuǎn)錄來的RNA片段形成發(fā)夾環(huán)，因為兩框中核苷酸含有互補(bǔ)堿基順序，這就迫使DNA/RNA雜交區(qū)域裂開，因而隨后包括氫鏈結(jié)合較弱的多聚腺苷酸和尿嘧啶mRNA分子就從這個位置脫離下來。 2．基因組可由DNA組成，也可由RNA組成，但不能共存于同一病毒。這些區(qū)域往往具有特殊的結(jié)構(gòu)，并且含有反向重復(fù)序列?？傊?，細(xì)菌基因組研究將使人類從更高層次上掌握病原微生物的致病機(jī)制及規(guī)律，從而得以發(fā)展新的診斷、治療、預(yù)防微生物感染的制劑、藥物及疫苗。高度重復(fù)序列，大多位于著絲粒和端粒、表達(dá)基因的間隔區(qū)、內(nèi)含子。假基因（pseudogene）在基因家族中，有些成員的序列與相關(guān)功能基因的序列相似，但不能被轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后生成無功能的基因產(chǎn)物。 斷裂基因? 即不連續(xù)基因。 限制性片段長度多態(tài)性? DNA位點(diǎn)多態(tài)性可影響限制酶的切割位點(diǎn)，造成限制性片段長度多態(tài)性，即用同一種限制酶消化不同個體的DNA時，會得到長度各不相同的限制性片段類型。 基因組研究大事記? １９９０年? １０月 被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計劃”的國際人類基因組計劃啟動。這段已知核苷酸序列的DNA片段稱為序列標(biāo)記位點(diǎn)，在基因組中應(yīng)有明確的位置。二、基因表達(dá)的方式（一）組成性表達(dá) 指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達(dá)。其DNA序列常與啟動序列交錯、重疊。正、負(fù)調(diào)控系統(tǒng)是按照沒有調(diào)節(jié)蛋白存在的情況下操縱子對于新加入的調(diào)節(jié)蛋白的響應(yīng)情況來定義的。單獨(dú)存在乳糖時，cAMPCAP復(fù)合物 與CAP位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，翻譯出三種酶，細(xì)菌可分解利用乳糖作為能源。單順反子：真核生物轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈，真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。分子克?。ɑ蚬こ蹋┣把远兰o(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)二十世紀(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì) 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制深刻意義在于：解決了基因自我復(fù)制和遺傳信息的傳遞問題50年代末和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼。③將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。 限制性內(nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。 …CAA TTG … 539。 端切割產(chǎn)生339。 。常用于離體條件下，合成單鏈RNA作為。5‘ …G▼AATT C…3’ 5‘ …N▼AATT N …3’ 星號活力 EcoR I * 誘發(fā)星號活力常見原因：高甘油含量（5%，V/V）內(nèi)切酶用量過大， （100U/181。 …CAA▲TTG…539。限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是指能識別DNA的特殊序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類酶。哺乳動物的克隆：克隆概念在個體水平上的應(yīng)用采用了核質(zhì)分離、細(xì)胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術(shù) 主要內(nèi)容①從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。（三） 小分子RNA(lin4RNA的影響1993年發(fā)現(xiàn)一種小分子lin4RNA像霉和調(diào)節(jié)蛋白那樣對真核生物的翻譯起阻抑作用。（二） mRNA的穩(wěn)定性增加mRNA 的穩(wěn)定性，延長 mRNA壽命，可提高翻譯水平。當(dāng)有葡萄糖存在時， cAMP濃度較低， cAMP與CAP 結(jié)合受阻，lac操縱子表達(dá)下降（4）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)Lac阻遏蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)與cAMP正性調(diào)節(jié)兩種機(jī)制協(xié)調(diào)合作無乳糖，無誘導(dǎo)物時，轉(zhuǎn)錄作用被I表達(dá)的阻遏蛋白所阻斷有誘導(dǎo)物時，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)，從操縱基因上解離出來。這類調(diào)節(jié)蛋白稱為阻遏蛋白或阻遏物。原核生物啟動子序列按功能的不同可分為三個部位，即起始部位、結(jié)合部位、識別部位。 基因表達(dá)調(diào)控：是指對基因組中某一個基因或一些功能相近的基因表達(dá)（生物體內(nèi)基因表達(dá)）的開啟、關(guān)閉和表達(dá)強(qiáng)度的直接調(diào)節(jié)。遺傳圖所表現(xiàn)的，是通過連鎖分析確定的各基因間的相對位置。? 1998年，最后一個五年計劃指定出來，HGP提前2年于2003年完成。例如人血液中的許多蛋白質(zhì)和紅細(xì)胞、白細(xì)胞的表面抗原在不同個體之間的生化特征、抗原特性都存在著由遺傳造成的變異。? 80%左右的mRNA來自單一序列DNA。 根據(jù)分布不同，可分為兩大類：（1）基因成簇地分布在一條染色體上，呈串聯(lián)排列，產(chǎn)生多個拷貝，具有幾乎相同的序列，同時發(fā)揮作用，如rRNA、tRNA、組蛋白等。與染色體的構(gòu)象、著絲點(diǎn)的形成有關(guān)。尋找病原菌所特有的DNA序列，提高臨床診斷的效率和準(zhǔn)確性。5. 無基因重疊結(jié)構(gòu)。對于二倍體高等生物來說，其配子的DNA總和即一組基因組，二倍體有兩份同源基因組。它需藉助於一般性轉(zhuǎn)錄因子才能來到啟動子區(qū)域，發(fā)揮聚合酶的功能。逆轉(zhuǎn)錄：以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下利用宿主細(xì)胞中4種dNTP為原料在引物的3’端以5’－3’方向合成與RNA互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）的過程稱逆轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的整個過程至少需包含以下步驟： (1)聚合酶來到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近。端位于復(fù)制起點(diǎn)的模板鏈，由于缺乏339。 第三講　相關(guān)基礎(chǔ)知識一、生物大分子通常將所有的生物分子簡單地分為兩類：一類是小分子，即為簡單的單體物質(zhì)；另一類是大分子，一般為多聚化合物。真核生物mRNA的特殊結(jié)構(gòu)252。 真核生物的三級結(jié)構(gòu)是該DNA雙鏈盤繞在組蛋白上的負(fù)超旋。l 自然界所發(fā)現(xiàn)的核苷酸主要為核苷C5’上羥基與磷酸形成的酯鍵，稱為5’核苷酸或一磷酸核苷。分子生物學(xué)的研究發(fā)展一．不斷把本學(xué)科的理論和技術(shù)引向深入 目前分子生物學(xué)研究的前沿：基因組研究、基因表達(dá)調(diào)控研究、結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究、信號傳導(dǎo)研究二。三。*分子生物學(xué)重要技術(shù)原理：基因工程技術(shù)（分子克隆）原理、DNA序列測定、核酸分子雜交、PCR、轉(zhuǎn)基因和基因打靶、DNA芯片技術(shù)的基本概念、原理及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用*分子生物學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)異常和調(diào)控異常與疾病發(fā)生的關(guān)系、基因診斷和基因治療的基本概念及其應(yīng)用第 一 章 緒 論第一節(jié)　分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容*分子生物學(xué)的基本含義研究對象 學(xué)科地位 是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快的前沿領(lǐng)域，正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域，生命科學(xué)的帶頭學(xué)科。二． 是分子生物學(xué)的重要分支三． 是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的帶頭學(xué)科第二節(jié) 分子生物學(xué)的歷史回顧孕育階段 Miescher核素。微生物工程：利用微生物特定性狀產(chǎn)生有用物質(zhì)，抗生素利用轉(zhuǎn)基因動、植物獲取多肽類藥物四、預(yù)防醫(yī)學(xué)疫苗研究：利用重組DNA技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動、植物技術(shù)可以改造病原體或有關(guān)蛋白成分，研制各種基因工