【文章內(nèi)容簡介】 含的試劑及物品:. Cell Resuspension Solution(A711B)，內(nèi)含RNase A:；. Cell Lysis Solution(A712B)，內(nèi)含NaOH和SDS，為堿裂解法；. Neutralization Solution(A713D)，為醋酸鉀；. Wizard Minipreps DNA Purification Resin(A767B). Column Wash Solution(A810B)，內(nèi)含55%乙醇及TE: . Wizard Minicolumn(A129A): . Syring Barrels(809B):二、 自備試劑和物品:. 。. 無菌蒸餾水或TE緩沖液。表格 1TE buffer配制方案試劑終濃度TrisHCl, 10mMEDTA1mM. 95%酒精。三、用前，用95%乙醇稀釋Column Wash Solution四、流程:. 將5 ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入5ml離心管或者10ml離心管中，離心，10,000g10min；. 細(xì)胞重懸:加入300ul Cell Resuspension Solution , 重懸細(xì)胞沉淀。. 細(xì)胞裂解:加入300ul Cell Lysis Solution , 顛倒4次混勻。. 蛋白沉淀:加入300ul(如果為endA陽性，則用量加倍)Neutralization Solution, 顛倒4次混合。. 將細(xì)菌溶解產(chǎn)物離心，10,000g10 min，室溫。此時可吸取20ul電泳鑒定質(zhì)粒大小；//樹脂用前需要強(qiáng)力振蕩混勻。f、g可先將樹脂吸入注射器中，然后用此注射器吸取細(xì)胞的裂解上清。. ，加入DNA純化樹脂1ml。. 用注射器取混合液，混勻，將混合液推入Minicolumn中。. ，推入Minicolumn中，液體流入廢液缸。. 將柱裝在離心管上，室溫離心，12,000rpm2 min。. 將柱移至新的離心管上，加入50ul水或TE，等1分鐘；離心，12,000g30sec，洗脫質(zhì)粒。. 棄去Minicolumn，將管中的質(zhì)粒貯存在4℃或20℃。限制酶酶切反應(yīng)質(zhì)粒的酶切，小量酶解反應(yīng)主要用于質(zhì)粒的酶切鑒定，~1ug DNA。流程:. ml離心管中依次加入下列試劑:表格 1雙酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒DNA(+水)?16ul10Buffer K(兼容體系)2ul限制酶: EcoRⅠ 1ul BamHⅠ1ul總體積20ul. 稍離心，混合。. 37℃水浴或溫箱，1~ h。. 取出后電泳分析鑒定是否酶解。 DNA的重組T載體連接(T/A cloning)(一)、試劑:. 外源片段DNA；. pGEM174。T載體，Promega: A1360, A180, A3600 and A3610//TM042；(二)、流程:. 將pGEM174。T離心至管底；. 建立以下連接體系(每次使用前切記將2Buffer振蕩混勻):表格 pGEM174。T連接體系成份10ul體系20ul體系2Rapid Ligation, T4 DNA Ligase需要按照每次用量分裝，避免多次凍融。5ul10ulpGEM174。T1ul1ulPCR product(含有粘性A末端)3ul(Maximum)8ul(Maximum)T4 DNA Ligase(3 Weiss units/ul)1ul1ul用Tip吹打混勻，室溫1h或4℃過夜說明:A、單次連接反應(yīng)中PCR產(chǎn)物最低濃度要求:表格 2單次連接反應(yīng)中PCR產(chǎn)物最低濃度要求PCR產(chǎn)物大小反應(yīng)體系最低含量要求每ul含量125ng~1kb250ng17ng~83ng2kb500ng34ng~166ngB、平端PCR產(chǎn)物加尾體系(for efficient T/A cloning):表格2平端PCR產(chǎn)物加尾體系成份加入量實(shí)用量參考純化的無A末端的PCR產(chǎn)物1~7ul7ulTaq DNA Polymerase 10Reaction Buffer with MgCl21ul1uldATP(from王升啟)Taq DNA Polymerase5units1ul(Takara產(chǎn)品)去離子水調(diào)整體積?10ul反應(yīng):70℃15~30min此步后可電泳回收，用10ul水溶解離心，吸取3ul(10ul體系)或者8ul(20ul體系)進(jìn)行連接反應(yīng)吸取1~2ul和pGEM174。T載體建立連接反應(yīng)可將10ul全部用于連接反應(yīng). 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化JM109宿主細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。粘端連接法㈠試劑及材料: 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1。 載體DNA:如pcDNA3；pET22B＋； 10Buffer K: 限制性內(nèi)切酶:BamH I； EcoR I； 去離子雙蒸水 10連接buffer T4DNA連接酶㈡操作程序: 制備目的基因片段和載體:建立如下酶切反應(yīng):表格 23去離子雙蒸水6ulDNA(1~3ug)10ul16ul10Buffer K2ul2ulBamH I1ul1ulEcoR I1ul1ul總體積20ul20ul 37℃，1~2h。瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因片段和線性化載體。 Ep管中建立連接反應(yīng):表格 24目的基因片段()13ul6ul載體DNA()4ul2ul10連接Buffer2ul1ulT4DNA連接酶1ul1ul去離子雙蒸水至總體積20ul10ul 16℃，12~16h。將連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，根據(jù)不同用途選擇不同菌種制備感受態(tài)細(xì)胞。平端連接法㈠試劑及材料 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1； 載體DNA:如pGEMT Vector System(Promaga) 去離子雙蒸水 TE() 10連接buffer或2連接buffer T4DNA連接酶㈡操作程序制備目的基因片段和線性化載體。 采用PCR技術(shù)從NDF1/pcDNA1中擴(kuò)增出NDF1片段。 去539。P的線性化載體(pGEMT):由試劑公司提供。 連接反應(yīng):表格 2連接反應(yīng)體系目的基因(平端)()7ul3ul載體(pGEMT)()1ul1ul10連接Buffer1ul2連接Buffer5ulT4DNA連接酶1ul1ul去離子雙蒸水至10ul10ul 16℃，16~24h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行克隆篩選鑒定。平粘端連接法(定向連接反應(yīng))㈠試劑及材料 含目的基因片段的DNA: 載體DNA 限制性內(nèi)切酶 T4DNA連接酶 Klenow大片段 2mM dNTP 10Klenow buffer㈡操作程序 制備目的基因片段和線性載體: 將載體雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收，使其兩端位點(diǎn)不同，防止連接時自身環(huán)化。 將含目的基因片段的DNA雙酶切，其中必需只有一種與載體酶切所有的酶相同；瓊脂糖凝膠電泳回收。 粘端連接: 目的基因片段和載體各有一匹配末端，先用T4DNA連接酶作用12h，將其連接起來； 而另一端不匹配，無法連接。此時即形成載體連接有目的基因的開環(huán)結(jié)構(gòu)。 Klenow補(bǔ)平反應(yīng)，將帶有目的基因載體兩端的粘性末端補(bǔ)平:表格 2連接反應(yīng)體系帶目的基因的載體()4ul10Klenow buffer2ulKlenow大片段1ul2mM dNTP2ul去離子雙蒸水至總體積20ul 室溫2h后，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。 溶于10ul TE()。平端連接: 再用T4DNA連接酶作用16~20h，使帶有目的基因片段的載體環(huán)化。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。克隆篩選鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備:感受態(tài)細(xì)胞；抗性平板；預(yù)熱SOC培養(yǎng)基；水浴42℃；制冰. IPTG stock solution(): IPTG(Cat. PromegaV3951)+50ml雙蒸去離子水，過濾除菌，4℃保存。. XGal(2ml):100mg IPTG(Cat. PromegaV3941)溶解于2ml二甲酰胺(N,N’dimethylformamide)中，鋁箔紙封口，20℃保存。. LB培養(yǎng)基:表格 2LB液體培養(yǎng)基配方Bacto174。tryptone10gBacto174。yeast extract5gNaCl5g去離子水?1000ml，高壓滅菌表格 2LB固體培養(yǎng)基配方Bacto174。tryptone10gBacto174。yeast extract5gagar15gNaCl5g去離子水?1000ml，高壓滅菌. 含有ampicillin的LB培養(yǎng)板:在1000ml LB培養(yǎng)基中加入15g agar(瓊脂)，高壓。冷卻至50℃左右時加入氨芐青霉素(Amp)至終濃度100ug/ml。按照30~35ml/85mm培養(yǎng)皿鋪板。凝固后置37℃中30min~1h，4℃保存?zhèn)溆谩? 含有ampicillin/IPTG/XGal的LB培養(yǎng)板:按上述方法制作LB培養(yǎng)板，加入ampicillin, IPTG和80ug/ml XGal后倒板。或者加入100ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml XGal至平板表面，37℃30min可完全吸收后使用。. SOC培養(yǎng)基:表格 2SOC培養(yǎng)基配方Bacto174。tryptoneBacto174。yeast extractNaCl, 1mol/L1mlKCl, 1mol/L雙蒸去離子水97ml攪拌助溶，高壓，冷卻至室溫Mg2+ stock, 2M, 已過濾除菌(實(shí)際可高壓)1mlGlucose, 2M, 已過濾除菌1ml. Mg2+ stock(2M)表格 Mg2+ stock(2M)MgCl26H2OMgSO47H2O雙蒸去離子水?100ml過濾除菌//實(shí)際可高壓流程(根據(jù) pGEM174。T說明書):. 準(zhǔn)備LB/Amp/IPTG/XGal平板，使用前將平板預(yù)熱至室溫；. 離心連接反應(yīng)管。 Epp離心管中；. 從70℃中取出冰凍的感受態(tài)細(xì)胞(如JM109)，置冰浴中約5min至剛剛?cè)诨?。輕輕晃動使細(xì)胞混勻；. 吸取50ul細(xì)胞至上述連接反應(yīng)管中；//實(shí)際吸取200ul感受態(tài)細(xì)胞. 輕晃Epp管以混勻，至冰上20min；. 于準(zhǔn)確調(diào)溫的42℃水浴中熱休克45~50sec，切勿輕晃、震動；. 將Epp管返回冰上2min；. 加入950ul已經(jīng)預(yù)熱到室溫的SOC培養(yǎng)基至Epp管中；//實(shí)際加入750ulSOC培養(yǎng)基. 搖菌:37℃(~150rpm)；. 鋪板:將100ul轉(zhuǎn)化體系鋪板至準(zhǔn)備好的LB/amp/IPTG/XGal平板；//實(shí)際此時才加入IPTG(4ul)+XGal(40ul) 或者其它篩選用抗生素，然后將1ml全部鋪板. 液體被吸收后倒置培養(yǎng)37℃過夜，后置4℃下以便藍(lán)白斑鑒定重組質(zhì)粒的鑒定a互補(bǔ)㈠原理:適用于含有b半乳糖苷酶基因(LacZ)的載體，載體含有LacZ的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息。㈡材料及試劑 XGal(5溴4氯3吲哚bD半乳糖苷):20mg/ml:20mg XGal溶于1ml二甲基甲酰胺，20℃避光保存。 IPTG(異丙基硫代bD半乳糖苷)(200mg/ml):1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水，定容至5ml，20℃保存。㈢操作程序:. 制備含相應(yīng)抗菌素(如Ap+、Mana+)的瓊脂平板。. 于平板表面加XGal 40ul和IPTG 4ul，用無菌玻璃涂布器將試劑均勻涂布于整個平板表面。37℃，1h至所有液體消失。. 將200ul轉(zhuǎn)化的菌液涂布于平板表面，37℃，20min后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)12~16h。. //實(shí)際使用:在20ul連接體系中加入200ul感受態(tài)細(xì)胞，加入780ul SOC培養(yǎng)基，加入IPTG(+4ul)和XGal(+40ul)至所需濃度，將此1ml菌液全部鋪板，超靜臺中吹干約1h，轉(zhuǎn)入倒置培養(yǎng)基中培養(yǎng)8~12h(常規(guī)為過夜)，然后將平板置4℃1~4h，觀察確定藍(lán)白斑。. 中止培養(yǎng)，將平板置4℃1~4h，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)。. 挑取白色菌落置3~5ml LB(含相應(yīng)抗生素如Ap)液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8~12h，提取質(zhì)粒，限制酶酶切分析進(jìn)一步鑒定。插入失活㈠原理:該法適用于有2個以上選擇標(biāo)志的載體。㈡試劑及材料 Ap tet 轉(zhuǎn)化菌㈢操作程序 制備LB瓊脂培養(yǎng)板分別含有Ap和tet。 將200ul轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含Ap培養(yǎng)板表面，置37℃20min后倒置培養(yǎng)12~16h。