分子生物學(xué)常用技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-14 00:50 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 龍膜 ? 特點(diǎn) –結(jié)合能力強(qiáng) –可反復(fù)雜交 –韌性強(qiáng) –適于電轉(zhuǎn)移印跡法 –對(duì) DNA小片段 (10bp)結(jié)合能力強(qiáng) ? 不足 –雜交信號(hào)本底較高 分子生物學(xué)考試 ? 時(shí)間： (晚 7:009:00) ? 地點(diǎn) – 9教講演廳 (150人 ) – 921 (50人 ) – 922 (50人 ) – 931 (50人 ) ? 答疑： (9:0011:30。 3:005:30) ? 地點(diǎn)：逸夫樓 3樓生化實(shí)驗(yàn)室 三、探針 (probe) ?探針的概念 ?探針的類型 ?標(biāo)記物的種類 ?標(biāo)記方法 1. 探針的概念 ?特異結(jié)合和檢測(cè)靶分子的活性物質(zhì) –抗原－抗體 –配體－受體 –同源 DNA/RNA 2. 探針的類型 ? 基因組 DNA探針 ? cDNA探針 ? RNA探針 ?寡核苷酸探針 ?蛋白質(zhì)或多肽探針 3. 標(biāo)記物的種類 ?放射性同位素 (32P, 3H, 35S, 125I, 14C) ?非放射性標(biāo)記物 –生物素 –地高辛 –熒光素 –酶 4. 核酸探針的放射性標(biāo)記方法 ? DNA缺口平移標(biāo)記法 ? 隨機(jī)引物標(biāo)記法 ? DNA的 5’ 末端標(biāo)記 缺口翻譯 特點(diǎn) ? 均一標(biāo)記 ? 制備 dsDNA探針 隨機(jī)引物標(biāo)記法 (random priming) ?隨機(jī)引物 –6nt –含有各種可能的排列順序 ?特點(diǎn) –放射比活性 缺口翻譯 – 操作簡(jiǎn)便 – DNA/cDNA 探針 DNA的 5’末端標(biāo)記 (5’ end labeling) ? 堿性磷酸酶＋ T4多核苷酸激酶 ? 標(biāo)記原理 ? 制備寡核苷酸探針 ? 制備短的 DNA/RNA探針 DNA的 5’末端標(biāo)記 四、 Southern 雜交 ? Southern blotting/DNA blotting ? 1975年， Edwen Southern等 ?印跡 (blotting) : 轉(zhuǎn)移 – blot: a spot or mark, esp. of ink – blotting 1. 印跡的方法 ?毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 ?電轉(zhuǎn)移法 ?真空轉(zhuǎn)移法 毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 電轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法 2. Southern 雜交的步驟 3. Southern 雜交的應(yīng)用 ?基因的定性及定量分析 ?基因的酶切圖譜分析 ?基因突變分析 ? RFLP 五、 Northern 雜交 ? RNA blotting ? 步驟 總 RNA/mRNA→ 變性電泳分離 → 轉(zhuǎn)移 →雜交 → 放射自顯影 /化學(xué)顯色 ? 應(yīng)用 –檢測(cè)組織 /細(xì)胞中 mRNA的大小 、 量 –比較不同組織 /細(xì)胞中基因的表達(dá)情況 Northern 雜交 六、 Western 雜交 ?免疫印跡 (immunoblotting) ? SDSPAGE→ 轉(zhuǎn)移 → 蛋白－第一抗體 → 標(biāo)記的第二抗
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