分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(編輯修改稿)
2025-05-01 23:13 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 酶提供相應(yīng)的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會(huì)減緩，因此使用時(shí)可根據(jù)每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間。要保證雙酶切實(shí)驗(yàn)的高效、準(zhǔn)確，就要選擇合適的通用buffer。這樣就能避免質(zhì)粒和基因沒有切動(dòng)或者被切散。常用的幾家內(nèi)切酶公司有MBI、 NEB、Promega、Roche、Takara，要查找雙酶切體系的通用buffer，最好到出品該內(nèi)切酶的公司網(wǎng)站上查詢。15. 緩沖液在電泳過程中的一個(gè)作用是維持合適的pH。電泳時(shí)正極與負(fù)極都會(huì)發(fā)生電解反應(yīng)，正極發(fā)生的是氧化反應(yīng)（4OH4e2H2O+O2)，負(fù)極發(fā)生的是還原反應(yīng)（4H++4e2H2)，長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，是溶液兩極的pH保持基本不變。電泳緩沖液的另一個(gè)作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移，例如，+離子，Na+離子的濃度太低時(shí)電泳速度變慢；太高時(shí)就會(huì)造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。電泳緩沖液還有一個(gè)組分是EDTA，加入濃度為12mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時(shí)激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。16.17. 對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，～2％之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象?？讖酱蟮沫傊恰?9. ⑴、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度最好從70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。對(duì)TG1菌株，OD600為0．5時(shí)，細(xì)胞密度在5107個(gè)/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。⑵、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。⑶、試劑的質(zhì)量所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。⑷、防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。⑸、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。20. TAE是Tris乙酸，緩沖容量小，但是溶解度大，易于儲(chǔ)存TBE是Tris硼酸，緩沖容量大，但是溶解度小，不易長(zhǎng)期儲(chǔ)存，易產(chǎn)生沉淀TAE與TBE的區(qū)別首先要知道 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：50x TAE Buffer (TrisAcetateEDTA) 242 gm Tris base ml Acetic acid 100ml EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to .10x TBE Buffer (TrisBorateEDTA) 108 gm Tris base 55 gm Boric acid gm Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is and requires no adjustment.它們的分別有下列幾點(diǎn)：1. TBE 不能太濃 (它只可有 10 times)，因?yàn)?borate 會(huì)很容易沉澱，但一般有少許沉澱是不會(huì)有太大問題。2. TBE 的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，分辨率 (resolution) 會(huì)比較高。3. 因?yàn)?TBE 有 borate 離子 (ion)，它會(huì)影嚮酵素 (enzyme) 的工作。因此，若要為分離出的 DNA 進(jìn)行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 一般比較模糊，但它不會(huì)對(duì)影嚮酵素三種緩沖液的配制方法Tris乙酸（TAE）：50濃貯存液（每升）：242g Tris 堿 冰乙酸100ml ()使用時(shí)再稀釋50倍。Tris磷酸（TPE）：10濃貯存液（每升）：108g Tris 堿 85％磷酸（ /ml）40ml ()使用時(shí)再稀釋10倍。Tris硼酸（TBE）：5濃貯存液（每升）：54g Tris 堿 硼酸20ml ()21. 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物
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