細(xì)胞與分子生物學(xué)-閱讀頁
2025-04-19 23:49本頁面
【正文】 板時(shí)的退火溫度，這是由于dI可以識(shí)別ATGC任意堿基，這樣就將核心序列的退火溫度提高到50℃左右，②連續(xù)的dI在較低溫度時(shí)，形成一個(gè)泡狀結(jié)構(gòu)，而使通用引物序列卷曲起來，不參與退火識(shí)別，而在較高溫度時(shí)形成線性分子，而使整條引物打開，參與退火識(shí)別；5＇端的通用調(diào)節(jié)序列是高溫識(shí)別的通用引物區(qū)。[10]只需通過瓊脂糖凝膠電泳就足以進(jìn)行分析ACP技術(shù)顯著提高了PCR 擴(kuò)增的特異性和敏感性，使得PCR產(chǎn)物的特異性大為增強(qiáng)。[11]ACP 是基于PCR 和普通瓊脂糖電泳的一種技術(shù)，簡單容易操作。[12] 速度快、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠ACP技術(shù)在較短時(shí)間內(nèi)就可克隆到可信的差異表達(dá)基因，且不需要花大量的時(shí)間來排除假陽性。[13]3 ACP DDRTPCR技術(shù)的應(yīng)用ACP 技術(shù)在差異表達(dá)基因克隆中的應(yīng)用，目前報(bào)道的主要集中于哺乳動(dòng)物（小鼠、牛和豬等）生殖發(fā)育相關(guān)的基因的研究[14]，通過該技術(shù)克隆了許多差異表達(dá)基因，為深入了解哺乳動(dòng)物早期生殖發(fā)育相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制提供了有利證據(jù)。將管標(biāo)號(hào)為1A,2A,PC A等。(2)混勻后稍離心。(4）準(zhǔn)備dNTP mix (以5管為例 ) 每管 5管 5第一鏈緩沖液 2μl 10μl dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/μl） 1μl 5μl 總 5μl 25μl(5）每管加入5μl，混勻后稍離心。(7）75℃ 10min終止反應(yīng)后置冰上，稍離心。(9) 將78μl ddH2O分別加入B管中,混勻。(11）將所有cDNA稀釋液 20℃保存待用。③ 將17μl PCR混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20μl。⑤ PCR循環(huán)參數(shù)： 在GeneAmp PCR Systems 2400 amp。⑥ 反應(yīng)結(jié)束后置20℃保存?zhèn)溆谩?2）預(yù)電泳30min。立即置冰浴。(5) 加樣2μl。(8)X光片70℃曝光過夜或更長時(shí)間(根據(jù)射線強(qiáng)度而定)。置X光片燈上比較尋找差異條帶。(3) 以原引物擴(kuò)增： 回收DNA 7 μl 10PCR buffer 5 μl 5mM dNTPmix μl 引物P μl 引物T μl Taq酶 2 μl 加ddH2O至總體積 50μl（4）執(zhí)行PCR程序: 93℃ 3min；93℃ 1min→60℃1min→68℃2min，20次循環(huán)；68℃5min。（6）PCR產(chǎn)物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。7．PCR產(chǎn)物的TA克隆。9．檢索分
化學(xué)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1