【正文】 2．解聚核蛋白并除蛋白 核酸 pI SDS結(jié)合蛋白質(zhì) 濃 KAc + SDS → SDS K ↓ b．有機溶劑 酚、氯仿 蛋白質(zhì)變性劑 酚、酚／氯仿－異戊醇、氯仿－異戊醇 注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管）， 處理酚（重蒸、緩沖液飽和、 % 8羥基喹啉） c． Proteinase K 處理 廣譜 ,水解力強 ,可在 SDS,EDTA存在下作用． 3．核酸的沉淀 a．乙醇 核酸的 Na, K 鹽在乙醇中 ↓ ? 調(diào)節(jié)鹽濃度： NaCl, NaAc, NH4Ac ? 加 冷乙醇（ ﹥ 95%） 攪出 DNA 或離心 ↓ ? 7075% 乙醇洗滌去鹽 除盡 EtOH,干燥 ? 溶于 TE (10mM TrisHCl pH ,1m MEDTA) ? 核酸濃度 ﹤ , 加助沉淀劑 ? 重復(fù)沉淀， 補鹽 ! b．異丙醇 M NaAc, 選擇性沉淀 DNA and 大 RNA, 體積小，不需 低溫放置． 沸點高，鹽 ↓ ，須 EtOH 洗滌． 4. 雜質(zhì)的去除 a. 小分子雜質(zhì) b. 多糖 ? 樣品預(yù)處理 動物 饑餓 植物 暗化 ? 選擇性沉淀 ? 異丙醇 糖與小分子 RNA不 ↓ ? CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） CH3 | CH3(CH3)15–N+–CH3 + NA– / \ CH3 CH3 CTANA ? NaNA ? (EtOH) + CTAAc（溶） Br NaAc 70% EtOH 1% NaCl 多糖溶解 c. RNA與 DNA 互為雜質(zhì) DNP 溶于 12M NaCl RNP 溶于 NaCl ? 除 RNA RNase( 100℃,15min 處理 ,除 DNase) ? 除 DNA RNasefree DNase 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、 pH、 EDTA…… DNA TE buffer,4 –20℃, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫 6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = RNA A260/A280 = 核酸的含量測定 (260nm,1cm 光徑 ) 1 A260 50μg/ml dsDNA 40μg/ml ssDNA, RNA 36μg/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量 , 定性 四 . 核酸的純化 ? 沉降速度法 被分離物質(zhì)在強大的離心力場中因 沉降速度 不同而分離 . (速度區(qū)帶超離心 ). ? 沉降平衡法 被分離物質(zhì)在離心時因 浮密度 不同進行分離 .(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心 ). ? 浮密度 ρ 是溶劑化密度 ,即核酸銫鹽水化物 ( CsCl,H2O,NA )的密度 . ? 不同介質(zhì)下 ,核酸的 ρ 不同 . CsCl ρ DNA= 。 兩個原子偏離糖平面的程度可以相等或不等 C2’endoC3’exo C2’exoC3’endo 側(cè)視圖 ? 存在 溶液 : Nt , Ns C2’endo ~ C3’endo DNA : BDNA C2’endo ADNA(RNA) C3’endo ZDNA 胞苷 (C) C2’endo ( 反式） 鳥苷 (G) C3’endo（順式 ） (Bform double DNA) (Aform double DNA) 三 . 核苷的順反構(gòu)象 ( synanti 構(gòu)象 ) 核糖和堿基以 N糖苷鍵連接成核苷，核苷中堿基平面繞糖苷鍵旋轉(zhuǎn)形成核苷的順反構(gòu)象。 扭轉(zhuǎn)角決定核苷的構(gòu)象 ? 存在 溶液 : 順反式可互換 結(jié)晶 : 順反式不可互換 C2’endo C3’endo 四 . 核酸的修飾成分及甲基化 1948年 小牛胸腺 DNA分離 m5dC 特點 : ? 原有成分的衍生物 ? 含量少 (百分之幾 ~萬分之幾 ) ? 主要化學(xué)鍵不變 60余種 Ura Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 ? 堿基上原子被其他基團取代 m p om …… ? AA衍生物 BaseCONHAA ? 糖衍生物 BaseCH2OH糖 (6C) ? 非嘌呤 ,嘧啶衍生物 ( tRNA ) W 異丙烯 Gua tRNA anticodon 3’鄰位 Q 7去 NGua tRNA anticodon 擺動位 RNA C2’OH 甲基化 ( Nm ) 抗水解 (Rnase ,[ OH175。Cs2SO4 ρ DNA= ? pH 不同 ,堿基結(jié)合 Cs﹢ 量不同 ,ρ 值不同 . 沉降速度超離心 沉降平衡超離心 原理 沉降速度不同 浮密度不同 梯度物質(zhì) 蔗糖 070% CsCl 密度 密度 ﹤NA 密度 包含ρ 離心力場 強 56萬 rpm 稍強 35萬 rpm NA↓ CsCl 成梯度 分子運動 向管底 5S 小 ↑ or↓ 于等密度處 16S rRNA ↓ (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA ) 離心時間 較短 免于 ↓ 管底 長 1