生化與分子生物學(xué)技術(shù)原理-免費(fèi)閱讀
【正文】 例 : pH 67 λmax λmin A 260 227 G 253 223 C 271 250 U 262 230 T 267 236 ? 不同波長(zhǎng)下吸收比值 A250/A260 A280/A260 A290/A260 注意點(diǎn) : ? 一般 λ max 250280, λmin 220250 吸收曲線特征與 pH 相關(guān) , pH 1,7,12 下測(cè)定 。 ? N糖苷鍵 堿穩(wěn)定 酸不穩(wěn)定 DNA RNA dNs Ns 嘌呤 Ns 嘧啶 Ns 酸堿作用比較 DNA RNA 堿 / 2’ or 3’Nt 產(chǎn)物 酸 Pu, Py, Pu, PyNt, 多聚核糖 P碎片 碎片 磷酸二酯鍵 嘧啶糖苷鍵 穩(wěn) 大 ? ? 定 ? 嘧啶糖苷鍵 磷酸二酯鍵 性 小 ? ? 嘌呤糖苷鍵 嘌呤糖苷鍵 2. β消除反應(yīng) 連接磷酸基團(tuán)的 βC 原子上有強(qiáng)的吸電子基團(tuán)存在時(shí) , 引起 αC 原子和 O 原子間的鍵斷裂。 構(gòu)象的改變并不伴隨共價(jià)鍵的破壞 核酸中的核糖有多種構(gòu)象 核糖的五員環(huán)不處于一個(gè)平面， C1， ， O，和 C4’ 三個(gè)原子在一個(gè)平面上， C2’ 或 /和 C3’ 偏離此平面，使核糖產(chǎn)生不同的構(gòu)象。dT) 隨機(jī)排列 poly A其區(qū)別使父母等位基因在胚胎中表達(dá)不同。 ? 苔黑酚法測(cè) RNA 核糖 糠醛 ? 二苯胺法測(cè) DNA 脫氧核糖 ω 羥基 γ 酮基戊醛 3H2O 2H2O 六 . 核酸組分的分離鑒定 1. 分離 a. 電泳分離 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解離及 pK值 ， Nts 間凈電荷 差異最大 . ADP質(zhì)子化狀態(tài) b. 層析 ? 離子交換層析 高效液相層析 ( HPLC ) ? 稀有成分纖維素薄板雙向?qū)游? 靈敏 , 快速 , 穩(wěn)定。Cs2SO4 ρ DNA= ? pH 不同 ,堿基結(jié)合 Cs﹢ 量不同 ,ρ 值不同 . 沉降速度超離心 沉降平衡超離心 原理 沉降速度不同 浮密度不同 梯度物質(zhì) 蔗糖 070% CsCl 密度 密度 ﹤NA 密度 包含ρ 離心力場(chǎng) 強(qiáng) 56萬(wàn) rpm 稍強(qiáng) 35萬(wàn) rpm NA↓ CsCl 成梯度 分子運(yùn)動(dòng) 向管底 5S 小 ↑ or↓ 于等密度處 16S rRNA ↓ (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA ) 離心時(shí)間 較短 免于 ↓ 管底 長(zhǎng) 12 天 時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 失敗 不變 操作 制備梯度 → 鋪樣 → 離 CsCl+樣品 → 混勻 心 → 收集 → 離心 → 收集 應(yīng)用 RNA,ssDNA,限制性 DNA 酶切片段 ? 測(cè) ρ ? 測(cè) (G + C)% ρ = + (G + C)% 天然、線狀、 ds DNA , 修飾少 . (G + C)% ~ 20 – 80% ? RNA , DNA 和蛋白質(zhì)的分離 中性 CsCl ρRNA , ρDNA , ρ蛋白 ρ: RNA RNA 5’Nt 定量測(cè)定 RNA 序列測(cè)定 ? 核糖的脫水反應(yīng) 酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產(chǎn)物與試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)。 扭轉(zhuǎn)角決定核苷的構(gòu)象 ? 存在 溶液 : 順?lè)词娇苫Q 結(jié)晶 : 順?lè)词讲豢苫Q C2’endo C3’endo 四 . 核酸的修飾成分及甲基化 1948年 小牛胸腺 DNA分離 m5dC 特點(diǎn) : ? 原有成分的衍生物 ? 含量少 (百分之幾 ~萬(wàn)分之幾 ) ? 主要化學(xué)鍵不變 60余種 Ura Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 ? 堿基上原子被其他基團(tuán)取代 m p om …… ? AA衍生物 BaseCONHAA ? 糖衍生物 BaseCH2OH糖 (6C) ? 非嘌呤 ,嘧啶衍生物 ( tRNA ) W 異丙烯 Gua tRNA anticodon 3’鄰位 Q 7去 NGua tRNA anticodon 擺動(dòng)位 RNA C2’OH 甲基化 ( Nm ) 抗水解 (Rnase ,[ OH175。生化與分子生物學(xué) 技術(shù)原理 曹凱鳴 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2022年 11月 第一章 核酸的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 一 .基本的化學(xué)組成 經(jīng)不同程度水解可獲得核酸各種組成部分 核苷酸 nucleotide Nt 核
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