分子生物學(xué)研究技術(shù)(理論)(文件)
【正文】 言（ introduction） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體（ plasimid vectors） 第二節(jié) 噬菌體載體（ phage vectors） 第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（ cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（ B/Y/HAC） 引 言 基因克隆的本質(zhì) 是使目的基因在特定的條件下得到 擴增和表達 ，而目的基因本身無法進行復(fù)制，所以就必須借助于 “載體” 及其 “寄主細胞” 來實現(xiàn)。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。 （ 4） 質(zhì)粒的復(fù)制類型 一種質(zhì)粒在宿主細胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 （ 6） 質(zhì)粒的存在形式 有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種， 雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋） 開環(huán)雙螺旋（一個裂口） 線狀雙螺旋（兩個裂口） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 （ plasimid vectors） 質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性 質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹 質(zhì)粒： 是一種裸露的雙鏈閉環(huán) DNA分子，它們在寄主細胞中能夠獨立地自我復(fù)制從而得到不斷的繁殖。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選自得到轉(zhuǎn)化的細胞（菌）。 因為這類菌落中 釋 放 出 的 藍色 物 質(zhì) 可 以將 整 個 菌 落染 成 藍 色 ，非 常 容 易 辨別 。 ? 但由于測序和引物合成的困難 ， 以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能 ， 所以 ， Khorana的設(shè)想被人們遺忘了 …… PCR技術(shù)簡史 ? DNA的復(fù)制 ? 核酸體外擴增的設(shè)想 ? 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ? 1985年 ， 美國 PECetus公司的 Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） ? 基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的 DNA復(fù)制 ? 最初采用 Ecoli DNA聚合酶進行 PCR， 由于該酶不耐熱 ， 使這一過程耗時 ， 費力 ， 且易出錯 ? 耐熱 DNA聚合酶的應(yīng)用使得 PCR能高效率的進行 ，隨后 PECetus公司推出了第一臺 PCR自動化熱循環(huán)儀 ? 1993年 ， Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 第 1輪結(jié)束 第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的反應(yīng)體系 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 標準的 PCR反應(yīng)體系 4種 dNTP混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 ? 靈敏度高 (pg=1012)量級擴增到微克 (ug=106
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