【正文】 AfMet 上的兩個(gè) Aa之間形成肽鍵。每合成一個(gè)肽鍵需要 2分子 GTP。 ? 原核生物釋放因子有 RF1,RF2,RF3。 二硫鍵的形成 氧化作用使兩個(gè) SH形成 SS 特定氨基酸的修飾 （ 1）磷酸化： Kinase使含羥基的 Aa加上磷酸基團(tuán) （ 2）糖基化： Asp,Ser,Thr,Asn等側(cè)鏈上加上糖基。 ? 蛋白合成的抑制劑 多數(shù)常見(jiàn)抗生素是蛋白合成抑制劑，抗感染?？勺鳛榭鼓[瘤藥物，抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成。 核蛋白的運(yùn)輸需要 （ 1）核運(yùn)轉(zhuǎn)因子（ importin, α、 β ) 。 （ 5） α、 β進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)下一個(gè)蛋白。 ? cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法 （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 提取組織總 RNA(mRNA,tRNA, rRNA) → mRNA與生物素標(biāo)記的 Oligo(dT)結(jié)合 → 加入親和素標(biāo)記的微磁球 → 親和素與生物素結(jié)合 → 磁場(chǎng)分離微磁球（ mRNA結(jié)合在微磁球上） → 洗脫mRNA (2)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 三種方法： a: Oligo(dT)為引物合成 cDNA b:由 6個(gè)堿基組成的隨機(jī)引物（ R6)合成 cDNA c: Oligo(dT)+R6合成 cDNA 反應(yīng)體系： mRNA, 引物， dNTP(dCTP為甲基化 dCTP),反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3）與噬菌體 DNA連接 （ 4）噬菌體顆粒的包裝與侵染 ? 完全基因敲除 置換型載體的正 — 負(fù)雙選擇（ positivenegative selection, PNS) ? 正向選擇：通過(guò)同源重組在靶基因內(nèi)部插入抗生素抗性基因（如 neor ）取代原基因，在抗生素培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆。 （ 4）以 oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄出 cDNA的第一條鏈。 （ 3）根據(jù)酶切位點(diǎn)序列和 cDNA的已知序列各設(shè)計(jì)一條引物， PCR擴(kuò)增。 ? 酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)（ yeast twohybrid system):研究蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用的一項(xiàng)技術(shù)。 首先構(gòu)建基因連鎖圖，將目的基因定位在染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)尋找緊密連鎖的RFLP或 RAPD分子。 ? 凝膠阻滯試驗(yàn) 凝膠阻滯試驗(yàn)（ Electrophoretic mobility shift assay, EMSA。含不同 ζ因子的RNA聚合酶識(shí)別不同基因啟動(dòng)子，從而調(diào)節(jié)不同基因的轉(zhuǎn)錄水平。 ? 乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)模型 ? 操縱子包括：調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)子、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因等。 CRP：代謝物激活蛋白，轉(zhuǎn)錄促進(jìn)蛋白。 ? 高濃度 NH3使胞內(nèi) Gln:α –KG的比例提高，胞內(nèi) GlnB蛋白與 NtrB結(jié)合，該復(fù)合體使磷酸化的 NtrC（活性）脫磷酸化，降低其它固氮基因的表達(dá)。 （ 3）真核生物在不同發(fā)育階段會(huì)發(fā)生 DNA的重排，原核生物該現(xiàn)象比較少見(jiàn)。 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)很大，可能遠(yuǎn)離啟動(dòng)子幾百到上千 bp，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合在這些位點(diǎn)結(jié)合，不直接影響啟動(dòng)子對(duì) RNA聚合酶的親和力，而是改變基因上游 DNA的結(jié)構(gòu)而影響 RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合。 基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增（ gene amplification）： 細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象，以便短時(shí)間內(nèi)大量累積基因產(chǎn)物，滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要，是基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。 ? 增強(qiáng)子可能作用機(jī)理 （ 1）影響模板附近 DNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)彎曲，或在反式作用因子參與下，以蛋白質(zhì)為媒介，使增強(qiáng)子與啟動(dòng)子“成環(huán)”，激活基因轉(zhuǎn)錄。其中 DBD結(jié)合在順式作用元件上，而TAD在激活 RNA聚合酶，引起下游基因的轉(zhuǎn)錄。這類(lèi)蛋白與 DNA結(jié)合時(shí)往往以二聚體的形式存在，兩個(gè)單體結(jié)合部位就是富含亮氨酸的部位，狀如拉鏈。 ? 同源域（ homeo domain ）： 同源盒編碼的 60個(gè)保守氨基酸序列。 特點(diǎn)： 具有帶負(fù)電荷的螺旋結(jié)構(gòu)，如 GAL4。 ? 癌基因（ oncogene）分類(lèi) : （ 1）病毒癌基因（ viral oncogene, vonc） : 病毒基因組中的某些基因，使細(xì)胞發(fā)生癌變，特別是一些擬轉(zhuǎn)錄病毒的基因。 LTR插入 LTR（ long terminal repeat） 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩側(cè)帶有 LTR，其內(nèi)有強(qiáng)啟動(dòng)子序列。 基因擴(kuò)增 低水平表達(dá)的原癌基因，經(jīng)擴(kuò)增后，增加了模板數(shù)量，使表達(dá)水平提高。 抑癌基因產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的惡性增殖。反轉(zhuǎn)錄酶以病毒 RNA為模板合成單鏈 DNA，并由宿主細(xì)胞 DNA聚合酶合成雙鏈 DNA（ 原病毒 ），經(jīng)環(huán)化后進(jìn)入細(xì)胞核并整合到染色體上，隨細(xì)胞的分裂傳代。 ? HIV的感染及致病機(jī)理 HIV除在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖造成細(xì)胞死亡外，還可通過(guò)以下幾種途徑導(dǎo)致免疫功能下降： ① HIV粒子表面的 gp120蛋白脫落，與正常細(xì)胞膜上CD4受體結(jié)合，使該細(xì)胞被免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為病毒感染細(xì)胞而遭殺滅； ②因 T細(xì)胞 CD4受體被 gp120封閉，影響了其免疫輔助功能； ③ HIV的 gp120蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗 CD4結(jié)合部位的特異性抗體，阻斷 T細(xì)胞功能； ④帶有病毒包膜蛋白的細(xì)胞可與其他細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞而喪失功能。 RNaseH部分消化前基因組 RNA，含“帽子”結(jié)構(gòu)不降解，作為引物，以（ ） DNA為模板，開(kāi)始合成（ +） DNA。以 RNA為模板，合成 +RNA, 再以 +RNA為模板，復(fù)制出 RNA。若為 Gln,則感染禽類(lèi)呼吸道上皮細(xì)胞，若為L(zhǎng)eu,則感染人類(lèi)呼吸道上皮細(xì)胞，若為 Met,則兩類(lèi)細(xì)胞都感染。 ? SARSCoV的侵染過(guò)程 病毒上的 S蛋白與宿主細(xì)胞膜上受體（如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶， ACE）結(jié)合，宿主細(xì)胞以?xún)?nèi)吞作用獲得病毒 RNA。 RNA聚合酶還以 RNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA, 進(jìn)而翻譯出多種蛋白。重排還會(huì)造成 Vκ的 3’端或 Jκ 5’端堿基的丟失和錯(cuò)誤，使 Ig的結(jié)構(gòu)更趨多樣性。 前后軸的形成 在果蠅發(fā)育的卵細(xì)胞階段，在長(zhǎng)橢圓形的卵細(xì)胞兩端分別差異性地錨定和貯存了特異性翻譯調(diào)控因子 bicoid和 nanos mRNA。該受體與調(diào)控果蠅腹側(cè)發(fā)育的外部信號(hào)是基因spatzl的表達(dá)產(chǎn)物。 ? 軀體基本發(fā)育模式 在囊胚層中，胚胎細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)自身基因產(chǎn)物（主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）。ppel 和 Knirps(kni)等。其功能是把間隙基因確定的區(qū)域進(jìn)一步分化成體節(jié)。 engrailed(en)和 wingless(wn)基因是兩個(gè)最重要的體節(jié)極化基因。根據(jù)這個(gè)模型，正常花的四輪結(jié)構(gòu)的形成是由三組基因共同作用而完成的。 A基因本身決定萼片， A和 B基因共同決定花瓣， B與 C基因共同決定雄蕊， C基因決定心皮。 （ 4）研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)節(jié)的作用。 （ 8）研究人類(lèi)個(gè)體之間的多態(tài)性（ SNP）情況，用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類(lèi)學(xué)的研究。 (6）研究 DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，為疾病診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 （ 2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。如其中任何一組或更多的基因發(fā)生突變而喪失功能，則花的形態(tài)將發(fā)生異常。軀體的某一部分最終發(fā)育成為無(wú)翅的前胸還是有翅的中胸，是有平衡器的后胸還是腹部的體節(jié)，都由同源域基因決定。 (3)體節(jié)極化基因 (segment polarity genes)。 （ 2）成對(duì)規(guī)則基因。 （ 1）間隙基因。 TOLL受體 Spatzle能使 DORSAL蛋白磷酸化從而引起該蛋白的重新分布，保證胚胎腹側(cè)的細(xì)胞核中 DORSAL蛋白濃度較高。 BICOID蛋白對(duì) caudal mRNA、 NANOS蛋白對(duì) hunchback mRNA的翻譯分別具有抑制作用，使 HUNCHBACK蛋白含量由前向后逐漸降低，而 CAUDAL蛋白的含量則漸次增高。 （ 2） VDJ與 C之間的重排 C片段中的 Cμ 片段存在兩個(gè) poly(A)添加信號(hào) μs mRNA和 μm mRNA. （ 3）基因突變引起的多樣性 VDJ基因重排后，突變頻率極高， C片段基因突變頻率則很低，造成了 Ig可變區(qū)多肽的多樣性進(jìn)一步增加。單一種系狀態(tài)的 Ig基因是不能表達(dá)的，只有經(jīng)過(guò)重排才有可能得到表達(dá)。 RNA聚合酶以基因組 RNA為模板合成 RNA。 NS1蛋白 92位氨基酸的突變導(dǎo)致人禽流感病毒致病力顯著增強(qiáng)。轉(zhuǎn)錄過(guò)程中， RNA依賴(lài)的RNA聚合酶切割宿主 mRNA形成具有帽子結(jié)構(gòu)的 RNA引物，引發(fā)轉(zhuǎn)錄。 DNA環(huán)化，形成不完全雙鏈 DNA，作為基因組進(jìn)行包裝。 HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，脫去外殼進(jìn)入細(xì)胞核， DNA聚合酶修復(fù)正鏈缺失部分，形成共價(jià)閉合的雙鏈 DNA，環(huán)狀 DNA在細(xì)胞核中大量復(fù)制。 主要過(guò)程如下： ①原病毒整合到宿主染色體上，無(wú)癥狀 。 細(xì)胞外信號(hào)（包括生長(zhǎng)因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等）作用于靶細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞膜受體系統(tǒng)或其它直接途徑被傳遞至細(xì)胞內(nèi)，再通過(guò)多種蛋白激酶的活化，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾，然后激活一系列基因轉(zhuǎn)錄。 ①癌基因產(chǎn)物本身模擬了生長(zhǎng)因子，因而與相應(yīng)的受體作用，以自分泌的方式刺激細(xì)胞生長(zhǎng)； ②癌基因產(chǎn)物模擬了已結(jié)合配體的生長(zhǎng)因子受體，從而在無(wú)外源生長(zhǎng)因子時(shí)提供了促進(jìn)細(xì)胞分裂的信號(hào)； ③癌基因產(chǎn)物作用于細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)控制途徑，解除此途徑對(duì)外源刺激信號(hào)的需求。 基因重排 包括：原癌基因與原癌基因之間的重排，也包括原癌基因與非原癌基因之間的重排，可能導(dǎo)致原癌基因表達(dá)水平的改變。 ? 原癌基因的表達(dá)調(diào)控 一、原癌基因在通常情況下以單拷貝形式存在，不表達(dá)或低水平表達(dá)，但通過(guò)點(diǎn)突變、插入、重排、缺失或擴(kuò)增在轉(zhuǎn)錄水平上提高其表達(dá)水平，原癌基因成為癌基因。 （ 2）高溫處理：胞內(nèi)變性蛋白增加，變性蛋白結(jié)合Hsp70，釋放 HSF， HSF聚合成三聚體，并發(fā)生磷酸化，與 HSE結(jié)合，促進(jìn)熱激蛋白表達(dá)。許多同源域蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，同源域可能參與了 DNA的結(jié)合。與 HTH的結(jié)構(gòu)不同， HLH結(jié)構(gòu)中的 α –螺旋氨基端與 DNA結(jié)合。 鋅指（ Zinc finger）結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)中含有鋅離子，多肽鏈局部突出，肽鏈中的Cys,His與 Zn2+ 形成配位鍵，狀如手指，鋅指環(huán)上的Arg， Lys等參與了反式作用因子與 DNA的結(jié)合。 （ 3）增強(qiáng)子還可能是反式作用因子或 RNA聚合酶進(jìn)入染色體的“入口”。 (2)基因變換（ gene conversion） :細(xì)胞 染色體上的基因，在 細(xì)胞發(fā)育的特定時(shí)期，該 基因可為另外的 基因所取代，從而 改變 遺傳性狀的現(xiàn)象。 （ 8）真核基因表達(dá)的很多蛋白通常存在翻譯后修飾過(guò)程，如糖基化、磷酸化；而原核表達(dá)蛋白的修飾作用較少。 （ 5）真核生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（ hnRNA）需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的剪接加工才能作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，而原核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通常不需要這些加工。 ? 真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在 DNA結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯方面存在的差異： （ 1）真核細(xì)胞的 DNA與組蛋白及非組蛋白結(jié)合，少量裸露；而原核細(xì)胞中的 DNA大部分裸露，少部分結(jié)合與 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶類(lèi)及調(diào)控蛋白。 （ 2）葡萄糖酵解產(chǎn)物降低 → 腺甘酸環(huán)化酶活性提高 → cAMP濃度增大 → cAMPCRP濃度提高 → 結(jié)合在 Plac上 → lacZ, lacY, lacA轉(zhuǎn)錄。 ， lacZ,lacY, lacA不表達(dá) 原因： （ 1） lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合在 lacO上， RNA聚合酶無(wú)法與 Plac結(jié)合， lacZ, lacY, lacA不轉(zhuǎn)錄。 小分子配基對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響 一些小分子化合物與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響某些基因轉(zhuǎn)錄。 ? DNA印足技術(shù) DNaseI足跡試驗(yàn)（ DNase I footprinting assay)：雙鏈 DNA的 5’端被同位素標(biāo)記后，加入適量的 DNaseI 切割，將 DNA切割成大小不等的若干片段，當(dāng) DNA某個(gè)部位被蛋白質(zhì)結(jié)合后，則限制了 DNaseI的作用而不被切割，經(jīng)過(guò)電泳、放射自顯影后，則缺少了某些條帶，形成空白足跡（ foot print） ,是研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。最后 ,通過(guò)染色體步移技術(shù)測(cè)定 RFLP分子和目的基因之間 的序列，找到目的基因。將上述三個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞， BD基因與目的基因融合表達(dá)產(chǎn)生誘餌（ Bait),AD基因與不同 cDNA融合表達(dá)產(chǎn)生獵物（ Prey），若誘